黑老虎果皮中总黄酮提取工艺研究

贺灵芝，李俊华，梁忠厚

(1.湖南环境生物职业技术学院 医药技术学院，湖南 衡阳 421005；2.衡阳师范学院，功能金属有机化合物湖南省重点实验室，湖南 衡阳 421008)

黑老虎(Kadsura coccinea)为五味子科南五味子属多年生常绿攀援藤本，广泛分布于湖南、贵州、福建、云南等地[1]。黑老虎是一种开发潜力较高的食药两用型野生水果，其含有丰富的氨基酸、矿物质元素和多酚类物质[2]。黑老虎的根茎俗称大血藤，是一种药用价值较高的中药材[3]。根茎中的活性成分如多酚类、木质素类、萜类及挥发油等具有抗氧化、抗炎抑菌、抗肿瘤、保肝、抗HIV、抗凝血和调节血脂等重要作用[4-5]。目前，对于黑老虎根茎的化学成分、药理作用及挥发油成分等研究较多，而如何从黑老虎果皮中提取有效药用成分还少见报道。

黑老虎果皮中主要有效药用成分为黄酮类化合物、多糖及多糖苷类、酯类、三萜类和微量元素等[6-7]，而黄酮类是天然活性成分检测的重要指标。近年来，黄酮类化合物的提取多采用超临界流体萃取法[8]、溶剂法[9]和超声波法[10]。其中，超声波提取法具有时间短、操作简便、溶剂用量少和效率高等明显优势而被广泛使用[11]。仿生态黑老虎接近野生黑老虎生长环境，研究它对维护生态可持续发展具有更大的意义[12]，所以本文采用超声波提取法提取仿生态黑老虎果皮中总黄酮，主要从提取时间、乙醇浓度、提取温度、料液比四个因素优化黑老虎果皮总黄酮提取工艺，并比较仿生态与组培黑老虎总黄酮含量区别，为总黄酮的提取及其药用价值的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

组培黑老虎果实产自福建龙岩市武平县齐仙布福娜种植专业合作社，仿生态黑老虎果实产自湖南环境生物职业技术学院林下种植基地，取11月组培黑老虎果实和仿生态黑老虎果实新鲜果皮去果肉，洗净低温烘干至恒重。

1.2 仪器与试剂

YB-1000A型多功能药物粉碎机(永康市速锋工贸有限公司)，KQ-100B型超声波清洗器(昆山市超声仪器公司)，TU-1810型紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，A124型万分之一电子分析天平(湖南轩彩科学仪器有限公司)。

无水乙醇、无水硝酸铝(AR)、氢氧化钠(AR)、亚硝酸钠(AR)、三氯乙酸(AR)、芦丁标准品(纯度＞98%)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3 检测方法

1.3.1 对照品溶液的配制

准确称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品100 mg，置于100 mL容量瓶中，加甲醇70 mL，置超声仪中超声溶解、冷却，加甲醇至定容刻度线，摇匀。准确吸取10 mL上述溶液置100 mL量瓶中，加水至刻度线、摇匀即得芦丁标准溶液(0.1 mg/mL)。

1.3.2 芦丁标准曲线的建立

准确量取对照品溶液(0.1 mg/mL)0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，各加30%乙醇使成5.0 mL，分别加入5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀后放置10分钟。再分别加入10%硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀后放置10分钟。最后再分别加l mol/L氢氧化钠溶液4.0 mL，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀后放置30分钟。用紫外可见分光光度计在400~800 nm波长范围内扫描，确定510 nm为其最大吸收波长。选择在510 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标(Y)，芦丁溶液浓度(X，mg/mL)为横坐标作标准曲线(图1)，得到回归方程式为：Y=5.5831X+0.0079，(R2＝0.999 7)。

图1 芦丁标准曲线

1.3.3 样品溶液的制备及其含量的测定

准确移取3.0 mL黑老虎果皮黄酮提取滤液于10 mL容量瓶中，按上述标准曲线制备相同的操作步骤测定样品的吸光度。根据标准曲线方程可得黑老虎果皮总黄酮浓度X，按下列公式计算总黄酮含量。

式中：X—每次测出的吸光度对应的黑老虎果皮中黄酮的浓度，M—黑老虎果皮粉末质量，C—容量系数，其值为Vm*Vo/Vn，Vm为定容体积，Vo为原液体积，Vn为从原液中移取的原液体积。

1.3.4 单因素试验

准确称取在120℃减压干燥至恒重的5 g黑老虎果皮，在其他因素一定的情况下，分别以不同提取温度(40，45，50，55，60，65，70℃)、提取时间(20，25，30，35，40，45，50 min)、乙醇浓度(40，50，60，70，80，90%)、超声功率(100，120，140，160，180，200 W)和料液比(1:5，1:10，1:15，1:20，1:25，1:30 g/mL)进行超声提取，趁热抽滤得滤液，测定黑老虎果皮中总黄酮提取率。

1.3.5 正交试验设计

试验因素与水平表设计根据单因素实验结果，选择提取温度(A)、提取时间(B)、乙醇浓度(C)、料液比(D)为自变量，以黑老虎果皮中总黄酮提取率为评价指标，采用L9(34)正交试验优化黑老虎果皮总黄酮提取工艺参数，正交实验因素水平设计如表1所示。

表1 正交试验因素水平表

2 结果与讨论

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对黑老虎果皮中总黄酮提取率的影响

图2 提取温度对提取率的影响

按超声提取时间40 min，乙醇浓度60%，料液比1:20，超声功率100 W于不同的提取温度下提取黑老虎果皮中总黄酮。如图2所示，在50~60℃之间，提取率随着温度的升高而增加，当温度为60℃时提取率最高，随后下降。说明随着提取的温度升高，分子之间运动激烈，有利于总黄酮随着有机溶剂渗出；而当温度过高时，黑老虎果皮总黄酮溶出量减少。出现该现象的可能原因是，首先高温下乙醇溶液蒸发得更快，乙醇浓度过高不利于黄酮渗出；另外温度过高时会破坏黄酮的化学结构，导致提取率下降。因此，黑老虎果皮中总黄酮的提取温度最好控制在60℃。

2.1.2 超声时间对对黑老虎果皮中总黄酮提取率的影响

按超声提取温度60℃，乙醇浓度60%，料液比1:20，超声功率100 W于不同的提取时间下提取黑老虎果皮中总黄酮。如图3所示，黑老虎果皮中总黄酮的提取率随着超声提取时间的延长而增高，提取率在35 min时达到最大值5.69%，随后时间延长提取率逐渐下降，提取率在45 min之后逐渐变得平稳。可能原因是提取时间较短时，黑老虎果皮中总黄酮并没有完全提取，所以时间增长提取率增大；然而加热时间较长时可能破坏黄酮的化学结构而导致黑老虎果皮中总黄酮提取率下降[13-14]，因此黑老虎果皮中总黄酮的超声提取时间最好控制在35 min。

图3 超声时间对提取率的影响

2.1.3 乙醇浓度对对黑老虎果皮中总黄酮提取率的影响

按超声提取温度60℃，提取时间35 min，料液比1:20，超声功率100 W于不同的乙醇浓度下提取黑老虎果皮中总黄酮。如图4所示，在乙醇浓度为40~80%，黑老虎果皮中总黄酮提取率随着乙醇体积分数的提高而逐渐增大，当乙醇浓度为80%时黑老虎果皮中总黄酮提取率达到最大值6.98%，随后提取率增加缓慢。根据“相似相溶”原理，黑老虎叶总黄酮的极性与80%乙醇极性相似，所以在乙醇浓度为80%时提取率最大；乙醇体积分数为90%时提取液中所含色素较多，会干扰测定。因此黑老虎果皮中总黄酮的超声提取乙醇浓度以70~90%之间为宜。

图4 乙醇浓度对提取率的影响

2.1.4 料液比对对黑老虎果皮中总黄酮提取率的影响

按超声提取温度60℃，提取时间35 min，乙醇浓度80%，超声功率100 W于不同的料液比下提取黑老虎果皮中总黄酮。如图5所示，在料液比为1:5~1:20之间，黑老虎果皮中总黄酮提取率随乙醇量增加而不断增大，在料液比为1:20时，黑老虎果皮中总黄酮提取率达到最大5.97%。然后随着料液比的增大呈现逐渐下降的趋势。原因可能为乙醇量增加可增大黄酮类物质与溶剂的接触面，故总黄酮提取率会增大；但当乙醇达到一定量后，物料与溶剂量的比例达到饱和状态，此时再增加溶剂的量对提取率影响不大，反而会使细胞内外浓度差降低使提取率下降。因此，黑老虎果皮中总黄酮的超声提取料液比应控制在1:15~1:25之间为宜。

图5 料液比对提取率的影响

2.1.5 超声功率对对黑老虎果皮中总黄酮提取率的影响

按超声提取温度60℃，提取时间35 min，乙醇浓度80%，料液比为1:20时于不同的超声功率下提取黑老虎果皮中总黄酮。如图6所示，超声功率在100~180 W时，黑老虎果皮中总黄酮提取率缓慢增大，提取率在超声功率为180 W时达到最大6.75%，超过180 W后，提取率迅速下降。一般而言，超声波可以最大限度的破坏黑老虎果的细胞壁使其内含物释放出来，样品中的黄酮会随着超声波处理时间的延长而越来越多地逸散出来；但超声波功率过强会破坏细胞结构和部分黄酮类化合物的结构，细胞中非黄酮的物质也不断溶出使有效成分的含量减少，导致在总黄酮含量测定时吸光度下降，提取率变小[14]。因此，黑老虎果皮中总黄酮的超声为功率180 W时最优。

图6 超声功率对提取率的影响

2.2 黑老虎果皮中总黄酮提取工艺优化结果

表2 正交试验结果

由表2正交试验结果可知，各因素影响黑老虎果皮中总黄酮提取的主次顺序为：提取温度＞料液比＞乙醇浓度＞提取时间，提取最优组合为A2B1C2D3，结合单因素实验结果，黑老虎果皮中总黄酮提取最优的实验方案为：提取温度为60℃，料液比1:25，乙醇体积分数为80%，提取时间35 min，提取功率为180 W，在最优实验方案下，重复超声提取6次取平均值，得黑老虎果皮中总黄酮提取率可达到6.69%。

2.3 与仿生态黑老虎果皮比较

称取组培、仿生态黑老虎新鲜果皮，洗净低温烘干至恒重，在最佳实验条件下提取总黄酮物质，比较结果如表3。从表中可见，仿生态黑老虎总黄酮提取率高于组培黑老虎果皮。可能原因是仿生态老黑虎的成长环境与组培黑老虎的成长环境不同，仿生态黑老虎在施用过生物炭的土壤中模仿野生生态环境生长[12-13]，使得仿生态黑老虎中黄酮类化合物的种类和含量都较组培黑老虎积累得更多。所以，仿生态黑老虎果皮总黄酮提取率高于组培黑老虎果皮总黄酮提取率。

表3 组培种植和仿生态种植黑老虎比较

3 结论

本研究以湖南、福建珍惜资源黑老虎果实为研究对象，以乙醇为提取溶剂，采用超声波辅助提取工艺，通过单因素及正交实验得到最优提取工艺条件为：提取温度60℃、提取时间35 min、乙醇体积分数为80%、料液比1:25、超声功率180 W，在此条件下黑老虎果皮总黄酮提取率可达6.69%。通过对比试验发现仿生态黑老虎果皮总黄酮提取率高于组培黑老虎果皮总黄酮提取率，其药用价值更高。