ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法测定火锅底料中三种喹噁啉类药物

马晓年　段海波　邹艳丽　张秀清　梁志坚　陈俊秀

摘要：采用超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱同时检测火锅底料中3种喹噁啉药物，样品经过乙腈-乙酸乙酯提取后，以乙腈-0.2%甲酸作为流动相，采用多反应检测正离子模式进行定性及定量分析。结果表明，3种喹噁啉类药物的线性关系良好，相关系数均在0.999以上，不同浓度的平均加标回收率在66.5%～84.4%，平均相对标准偏差为6.8%～9.2%，该方法适用于火锅底料中3种喹噁啉类药物残留的检测。

关键词：3-甲基喹噁啉-2-羧酸;乙酰甲喹;喹烯酮;UPLC-MS/MS;火锅底料

中图分类号：O657.63;TS264.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）03-0126-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.027

Determination of 3 quinoxaline drugs in hotpot seasoning by UPLC-MS/MS

MA Xiao-nian1，DUAN Hai-bo2，ZOU Yan-li3，ZHANG Xiu-qing1，LIANG Zhi-jian1，CHEN Jun-xiu1

（1.Kunming Center for Disease Control and Prevention，Kunming 650228，China;2.Yunnan Tobacco Industry Co.，Ltd. Technology Center，Kunming 650231，China;3.Chuxiong Normal University，Chuxiong 675000，Yunnan，China）

Abstract： UPLC-MS/MS was used to simultaneously detect three quinoxaline drugs in the hotpot seasoning. After the sample was extracted by acetonitrile ethyl acetate， acetonitrile-0.2% formic acid water was used as the mobile phase， and the multi reaction detection positive ion mode was used for qualitative and quantitative analysis. The results show that the linear relationship of the three quinoxaline drugs is good， the correlation coefficient is above 0.999， the average recovery of different concentration is 66.5%～84.4%， and the average relative standard deviation is 6.8%～9.2%. This method is suitable for the detection of  residual pollution in hotpot seasoning.

Key words： methyl-3-quinoxaline-2-carboxylic acid; mequindox; quinocetone; UPLC-MS/MS; hotpot seasoning

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）均屬喹噁啉类化药物，该类药物可显著促进动物生长，且具有较强的抑菌作用[1]，广泛用于猪、牛、鸡、羊的促进生长、抗菌治病。但该类化合物有较强的蓄积毒性和遗传毒性，其在动物体内造成的残留严重危害了消费者的健康。有学者对喹噁啉类药物残留从前处理到分析方法进行了研究[2-7]，并分析了不同种类的样品。在前人研究工作的基础上，本试验对样品前处理方法进行了优化，建立了火锅底料中3-甲基-喹噁啉-2-羧酸（MQCA）、乙酰甲喹（MEQ）、喹烯酮（QCT）的超高效液相色谱-串联三重四级杆质谱（UPLC-MS/MS）检测方法。

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

QTRAP 4500质谱分析仪（美国 AB SCIEX）;Agilent 1290高效液相色谱仪（美国安捷伦）;高速冷冻离心机（湖南 赫西仪器）;振荡器（常州金坛恒丰仪器制造有限公司）;超声仪（昆山市超声仪器有限公司）;氮吹仪（Reeko Auto EVA-30）;电子天平（METTLER，0.01 mg）;均质器。

3-甲基喹噁啉-2-羧酸（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH），乙酰甲喹（BEIJING MANHAGE BIO-TECH CO.，LTD.），喹烯酮（德国Dr.Ehrenstorfer GmbH）;甲醇、乙酸乙酯、乙腈、甲酸均为色谱纯;浓盐酸、正己烷均为分析纯;试验用水为超纯水。

1.2  方法

1.2.1  标准溶液的配制  分别称取MQCA、MEQ、QCT标准品4.30、3.30、4.10 mg，用甲醇溶解并定容至20 mL制成母液。再取MQCA、MEQ、QCT各50 μL定容至50 mL棕色容量瓶中，配成MQCA、MEQ、QCT浓度分别为215、165、205 ng/mL的标准储备液，于-18 ℃避光保存。使用时根据需要配制适当浓度的标准使用液。

1.2.2  样品前处理  称取5.00 g（精确至0.01 g）均质后的火锅底料样品至50 mL离心管中，加入15 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），混匀后置于（47±3） ℃水浴振摇15 min，超声提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min离心8 min，收集上层有机相，残渣中再加入15 mL乙腈-乙酸乙酯（1∶1，V/V），重复上述步骤再提取1次，合并上层有机相。

向乙腈-乙酸乙酯提取后的残渣中加入10 mL磷酸盐缓冲液，置于（47±3） ℃水浴振摇15 min，超声提取10 min，10 ℃ 7 000 r/min离心8 min，收集上清液与上述有机相合并。于40 ℃下氮气吹至近干，加入1.5 mL含0.1%甲酸的20%甲醇溶液溶解残留物，加入1 mL正己烷振荡脱色，7 000 r/min离心8 min，除去正己烷层，下层过0.22 μm滤膜，供UPLC-MS-MS测定。

1.3  UPLC-MS/MS条件

1.3.1  UPLC条件  色谱柱：岛津Inertsil ODS-3柱（3 μm，2.1 mm×100 mm）;流动相A为0.2%甲酸-水，流动相B为乙腈，梯度洗脱程序见表1;流速0.30 mL/min，分析时间为5 min，进样体积5 μL，柱温30 ℃。

1.3.2  质谱条件  电离电压4.5 kV;多反应检测（MRM）;离子源温度450 ℃;喷雾器压力275.8 kPa;气帘气压力241.325 kPa;辅助气流速40 μL/min;其他参数见表2。

2  结果与分析

2.1  提取溶剂的选择

采用各类溶剂提取动物源性食品中喹噁啉类药物残留已有文献报道，常用有乙腈、甲醇、乙酸乙酯等单一溶剂体系或二相、三相溶剂体系。本研究比较了乙腈-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈-甲醇-乙酸乙酯（1∶1∶1）、乙腈-甲醇（1∶1）、甲醇-乙酸乙酯（1∶1）、乙腈、甲醇、甲醇-水（1∶1）、乙腈-水（1∶1）的提取效果。结果表明，甲醇-水（1∶1）及乙腈-水（1∶1）的提取效果不佳，而其他溶剂体系均有一定的提取率，其中乙腈-乙酸乙酯（1∶1）及甲醇-乙酸乙酯（1∶1）提取率最高，回收率均能达75%以上。乙腈提取时，杂质相对较少，能减轻离子源的负担。乙酸乙酯对脂溶性大的MEQ和QCT有较好的提取率，故本研究采用乙腈-乙酸乙酯（1∶1）作为提取溶剂。

2.2  基质效应的消除

在应用LC-MS/MS测定复杂样品（如动物源食品及生物样本）时，基质通常对分析物的离子化具有增强或抑制效应，此为基质效应。基质效应影响仪器的灵敏度和重复性，是可靠定性及准确定量的重要影响因素。主要采用以下手段减少基质效应：①通过优化色谱分离条件使得内源性杂质与待测物分离;②保留时间靠前，比较容易受基质效应的影响，试验适当地增加待测组分的分离时间，使之在2 min后出峰以减少基质效应;③采用较低流速使同时离子化的化合物减少，降低待测组分与基质成分在电离过程中的竞争，从而减弱基质效应;④在保证灵敏度的情况下，采用小进样体积降低基质效应。

2.3  流动相的选择

本试验有机相分别采用了甲醇、乙腈、甲醇-乙腈混合溶液，水相分别采用了含0.1%甲酸、含0.2%甲酸，将有机相和水相进行两两搭配进，结果发现乙腈有改善峰形的作用， 0.1%甲酸-乙腈及0.2%甲酸-乙腈均能分离测定两个物质，但在0.2%甲酸-乙腈体系下，待测组分的响应较高且峰形窄。图1为各流动相下的TIC图。考虑到操作的简便及分离的效果，试验最终确定流动相为0.2%甲酸-乙腈。

2.4  质谱条件的优化

根据待测物的性质，配制MEQ、MQCA、QCT浓度分别为165、215、205 μg/mL的标准溶液，在ESI+模式下分别进行质谱条件优化，第一步进行母离子扫描，确定母离子，优化得到去簇电压和碰撞电压。并在MRM模式下优化了气帘气、离子源温度、喷雾气、辅助加热气。

2.5  方法研究及结果分析

2.5.1  线性范围、回归方程和检出限  分别配制MQCA的质量浓度为4.3、21.5、43.0、129.0、215.0 μg/L，MEQ的质量浓度为3.3、33.0、99.0、165.0、264.0 μg/L，QCT的质量浓度为4.1、20.5、41.0、123.0、205.0 μg/L系列混合标准溶液。以目标组分的峰面积（y）对质量浓度（x）做标准曲线。3种化合物的线性关系、相关系数、方法检出限见表3。

2.5.2  方法回收率和精密度  空白样品每份5.00，共3组，分别添加7.5、15.0、30.0 ng MQCA，5.0、15.0、30.0 ng MEQ，7.5、15.0、30.0 ng QCT，测定结果见表4。从表4可以看出，不同浓度的平均加标回收率在66.5%～84.4%，平均相对标准偏差为6.8%～9.2%。图2为标准品及加标样品中MRM色谱。

3  结论

建立了同时检测火锅底料中3-甲基喹噁啉-2-羧酸、乙酰甲喹、喹烯酮残留的UPLC-MS/MS分析方法，通过对样品处理条件和仪器条件进行优化，使得方法简便、经济。该方法操作简单、灵敏、稳定，可满足火锅底料中3种喹噁啉类药物残留的检测。

参考文献：

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收稿日期：2019-06-10

基金项目：昆明市卫生人才科技人才培养项目[2017-sw（后备）-66]

作者简介：马晓年（1985-），女（壮族），云南临沧人，主管技师，硕士，主要从事食品质量与安全工作，（电话）13888021164（电子信箱）179267837@qq.com;通信作者，陈俊秀（1988-），女，云南玉溪人，初级检验师，主要从事理化分析工作，（电子信箱）752110643@qq.com。