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吴茱萸中总黄酮的提取及其抗氧化活性研究

2020-05-18赵楠景云荣何婷婷柴军红宛春雷张蕾

湖北农业科学 2020年3期
关键词:抗氧化活性总黄酮提取工艺

赵楠 景云荣 何婷婷 柴军红 宛春雷 张蕾

摘要:以芸香科吴茱萸属植物吴茱萸(Evodia rutaecarpa)为原料,吴茱萸总黄酮的含量为指标,在单因素试验的基础上,采用正交设计法优化总黄酮的提取工艺。所得最佳提取工艺为乙醇体积分数70%、固液比1∶50、提取时间40 min、提取温度65 ℃,在此条件下总黄酮得率为8.82%。DPPH·自由基清除试验评价吴茱萸总黄酮体外抗氧化活性表明,吴茱萸总黄酮具有良好的抗氧化活性。

关键词:吴茱萸(Evodia rutaecarpa);总黄酮;提取工艺;抗氧化活性

中图分类号:R284.2;S567.1+9         文献标识码:A

文章编号:0439-8114(2020)03-0118-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.03.025

Study on extracting and antioxidant activity of total flavonoids from Evodia rutaecarpa

ZHAO Nan,JING Yun-rong,HE Ting-ting,CHAI Jun-hong,WAN Chun-lei,ZHANG Lei

(Mudanjiang Normal University,Mudanjiang 157011,Heilongjiang,China)

Abstract: Taking Evodia rutaecarpa as raw materials, and total flavonoids content as the index, on the basis of single factor experiment, the optimization of extraction of flavonoids from Evodia rutaecarpa was investigated by orthogonal experimental design. The optimum conditions were ethanol concentration at 70%, solid-liquid ration at 1∶50, extraction time at 40min and extraction temperature at 65℃. The results showed that the extracting rate of total flavonoids reached 8.82%. The antioxidant activity of flavonoids from Evodia rutaecarpa had good ability to scavenge DPPH· free radical.

Key words: Evodia rutaecarpa; total flavonoids; extract process; antioxidant activity

吴茱萸(Evodia rutaecarpa)为芸香科植物吴茱萸、石虎或疏毛吴茱萸的干燥成熟果实,是中国传统中药,贵州道地药材[1],具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效[2]。现代药理学研究表明,吴茱萸具有抗炎镇痛[3]、降压[4]、抗肿瘤[5]、心肌保护[6]等多种作用。吴茱萸的化学成分丰富,主要包括生物碱[7]、柠檬苦素[8]、黄酮[9]、挥发油[10]等,其中对生物碱类成分的研究最为深入,而对吴茱萸中黄酮类成分研究较少。吴茱萸中黄酮类成分主要为黄酮及其苷类,其结构丰富多样,为吴茱萸药材的药理活性奠定了物质基础。目前对于吴茱萸中总黄酮及其抗氧化活性的研究鲜有报道。

本试验以吴茱萸药材为原料,通过超声提取法研究乙醇体积分数、固液比、提取温度、提取时间4个因素对吴茱萸中总黄酮得率的影响,应用正交设计试验优化提取总黄酮的工艺,通过清除DPPH·自由基法评价吴茱萸总黄酮的抗氧化活性,以期为吴茱萸的资源开发与合理利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  吴茱萸购于河北安国药材市场,粉碎备用。乙醇(分析纯,天津进风化工有限公司),芦丁标准品(≥98%,贵州迪大科技有限公司),NaNO2(天津市大茂化学试剂厂),Al(NO3)3(天茂化工有限公司)。

1.1.2  主要仪器  紫外分光光度计(普析通用仪器有限责任公司),电子分析天平(塞利多斯科学仪器有限公司),超声清洗仪(标和仪器有限公司),旋转蒸发仪(Yamato科技贸易有限公司)。

1.2  方法

1.2.1  总黄酮的提取  吴茱萸果实干燥后,粉碎过筛,准确称取1.0 g粉末置于锥形瓶中,加入一定体积分数的乙醇溶液,在一定温度下,超声波辅助法加热提取。

1.2.2  芦丁标准曲线的绘制  芦丁标准品恒温干燥后,精密称取20.0 mg,60%乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中,制成0.2 mg/mL的芦丁标准溶液。分别准确吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL具塞比色管中,再依次分別加入4.0、3.0、2.0、1.0、0.0 mL 30%乙醇,每个具塞比色管中加入5%的NaNO2溶液0.3 mL,摇匀,静置6 min后,再加入10%的Al(NO3)3溶液0.3 mL,摇匀,静置6 min后,再加入1 mol/L的NaOH溶液4.0 mL,30%乙醇定容至10 mL,摇匀后静置15 min,于510 nm下测定吸光度。

1.2.3  总黄酮的检测  准确吸取“1.2.1”提取溶液  1 mL,按照芦丁标准曲线绘制的步骤,在510 nm下测定吸光度,计算总黄酮得率。试验重复3次,取平均值。

1.2.4  单因素试验

1)乙醇体积分数的选择。固定提取温度为50 ℃、固液比为1∶30、提取时间30 min的条件下,乙醇体积分数分别为20%、40%、60%、80%、90%,研究不同体积分数的乙醇对吴茱萸中总黄酮得率的影响。

2)固液比的选择。固定乙醇体积分数为80%、提取时间为30 min、提取温度为50 ℃,按照固液比分别为1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶90,研究固液比对吴茱萸中总黄酮得率的影响。

3)提取时间的选择。固定乙醇体积分数为80%、固液比为1∶40、提取温度为50 ℃,提取时间分别为15、30、45、60、75 min,研究不同提取时间对吴茱萸中总黄酮得率的影响。

4)提取温度的选择。固定乙醇体积分数为80%、固液比为1∶40、提取时间为45 min,提取温度分别为30、40、50、60、70 ℃,研究不同提取温度对吴茱萸中黄酮得率的影响。

1.2.5  正交试验设计  在单因素试验的基础上,以乙醇体积分数、固液比、提取时间、提取温度为试验因素,以总黄酮得率为指标,设计正交试验L9(34)优化总黄酮的提取工艺。试验的因素与水平见表1。

1.2.6  抗氧化活性  参考文献[11]的方法并稍加改动,以抗坏血酸为对照,在具塞比色管中依次加入0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL、无水乙醇2 mL和不同浓度的抗坏血酸溶液或吴茱萸黄酮溶液2 mL,混匀后,避光放置30 min,于517 nm处测定吸光度A0、A1、A2,重复试验3次,计算不同浓度下对DPPH·的清除率。

2  结果与分析

2.1  线性关系考察

依据“1.2.2”项下方法绘制标准曲线,以吸光度(y)对芦丁标准品的浓度(x)进行线性回归。芦丁标准品在0.01~0.05 mg/mL与吸光度相关性良好,回归方程为y=1.272 x-0.001,R2=0.999 8。

2.2  单因素试验结果

2.2.1  乙醇体积分数对吴茱萸总黄酮得率的影响  由图1可知,吴茱萸中总黄酮得率随乙醇体积分数增加而增大,在乙醇体积分数为80%时,吴茱萸总黄酮得率最高,乙醇体积分数为90%时,得率开始趋向于平缓并略有降低,可能是由于乙醇体积分数过高导致极性较大的黄酮溶解度降低。因此选择乙醇体积分数70%~90%进行正交试验。

2.2.2  固液比对吴茱萸总黄酮得率的影响  由图2可知,在固液比为1∶40时,吴茱萸总黄酮的得率达到最大,提取溶剂的量增加后,总黄酮得率反而降低,提取时间也相应延长,在限定的时间内得率有所下降。因此,选择固液比1∶30~1∶40进行正交试验。

2.2.3  提取时间对吴茱萸总黄酮得率的影响  由图3可知,在提取时间小于45 min时,总黄酮得率随提取时间增加而增大,当提取时间大于45 min后,总黄酮得率有下降趋势,可能是由于提取时间增加,黄酮苷类被水解,所以吸光度有所下降。因此,选择40~50 min进行正交试验。

2.2.4  提取温度对吴茱萸总黄酮得率的影响  由图4可知,吴茱萸总黄酮吸光度随提取温度的升高而增大,当提取温度为60 ℃时,吴茱萸中总黄酮得率达到最大,在提取温度为70 ℃时,开始趋向于平缓并且略有降低,可能是由于温度过高,乙醇挥发较多,同时对热不稳定的黄酮被破坏,降低了总黄酮得率。因此,选择55~65 ℃进行正交试验。

2.3  正交试验

根据单因素试验结果,选择4因素3水平设计正交试验L9(34),优化吴茱萸中总黄酮的提取工艺,考察指标为总黄酮得率,正交试验结果见表2。由表2可知,各提取因素的影响顺序为提取温度>固液比>提取时间>乙醇体积分数,正交试验最佳工艺为A1B3C1D3,即乙醇体积分数70%,固液比1∶50,提取时间40 min,提取温度65 ℃。在最优工艺参数下,进行重复性试验验证工艺稳定性。取待测样品5份,测试总黄酮平均得率为8.82%,相对标准偏差为2.13%,表明该工艺参数较稳定。

2.4  抗氧化活性结果

以抗坏血酸为对照,DPPH·清除能力的测定结果见图5。由图5可知,在浓度小于0.015 mg/mL时,吴茱萸总黄酮对DPPH·的清除率略优于抗坏血酸,表明吴茱萸总黄酮具有良好的抗氧化活性。

3  小结

在单因素试验的基础上,采用超声提取法,通过正交试验对吴茱萸中总黄酮的提取工艺进行优化,得到吴茱萸总黄酮提取的最优工艺为乙醇体积分数70%、固液比1∶50、提取时间40 min,提取温度65 ℃,总黄酮得率为8.82%,且该工艺具有良好的稳定性。同时,通过测试清除DPPH·自由基能力,以抗坏血酸为对照评价吴茱萸总黄酮的抗氧化活性,结果表明,吴茱萸总黄酮对DPPH·自由基清除能力略優于抗坏血酸。研究首次采用超声提取法对吴茱萸药材中总黄酮的提取工艺及其体外抗氧化活性进行研究,旨在为吴茱萸药材的开发利用以及后续研究提供参考。

参考文献:

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[4] 龚慕辛,王智民,张启伟,等.吴茱萸有效成分的药理研究进展[J].中药新药与临床药理,2009,20(2):183-187.

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[6] 許青媛,杨甫昭,陈春梅.吴茱萸温通血脉的药理研究[J].中药药理与临床,1994(2):35-37.

[7] ZHAO N,LI Z L,LI D H,et al. Quinolone and indole alkaloids from the fruits of Euodia rutaecarpa and their cytotoxicity against two human cancer cell lines[J].Phytochemistry,2015,109:133-139.

[8] 赵  楠,李达翃,李占林,等.吴茱萸化学成分的分离与鉴定[J].沈阳药科大学学报,2016(2):103-109.

[9] 赵  楠,李占林,李达翃,等.吴茱萸中1个新的苯丙素苷类化合物[J].中草药,2015,46(1):15-18.

[10] 王  锐,倪京满,马  星.中药吴茱萸挥发油成分的研究[J].中国药学杂志,1993,28(1):16-18.

[11] 艾  薇,李  悦,匡建秋.藿香叶黄酮提取工艺优化及其体外抗氧化活性[J].食品工业而科技,2018,39(22):187-191.

收稿日期:2019-05-06

基金项目:黑龙江省教育厅项目(1354MSYYB004);牡丹江师范学院科研项目(QN2019004);牡丹江市科技攻关项目(Z2018S070);黑龙江省北方药食技术工程中心专项(PT2018011)

作者简介:赵  楠(1989-),女,黑龙江牡丹江人,讲师,博士,主要从事天然产物研究与开发,(电话)13845302432(电子信箱)swxzn0@126.com。

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