miR-375靶向Pax6基因调控视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖凋亡的分子机制

桂玉敏 彭建军 郭敬

视网膜母细胞瘤是视网膜中最常见的原发性恶性肿瘤，通常发生在婴幼儿时期，占所有儿童恶性肿瘤的3%左右[1]。目前，尽管视网膜母细胞瘤的治疗策略取得了一定的进展，但发生颅内及远处转移常危及患儿生命。鉴于此，有必要进一步探索视网膜母细胞瘤发生和发展的分子机制，并开发有效的治疗方法，包括分子靶向治疗。越来越多的证据表明，各种微小RNA(microRNA，miRNA)的异常表达通常存在于人类各种类型的癌症中，包括视网膜母细胞瘤，这表明miRNA在癌症发生和癌症进展中的潜在功能[2-4]。miRNA是一类单链，长度约23个碱基的非编码RNA，通过与mRNA的3'非翻译区(UTR)结合，作为其靶mRNA的负调节因子，导致靶向降解或翻译抑制。由于miRNA在癌症起始和进展中的调节功能，应当将miRNA的靶向作为新的治疗策略进行研究。多项研究表明，miR-375在食管癌、胃癌、骨肉瘤、宫颈癌等多种类型的癌症中异常表达，发挥抑癌基因的作用[5-7]。然而，目前，miR-375影响人视网膜母细胞瘤细胞生物学过程的潜在分子机制仍然很大程度上未知。因此本研究探讨miR-375对人视网膜母细胞瘤细胞增殖和凋亡的影响，并探究其靶基因，以期为视网膜母细胞瘤的靶向治疗提供新的作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人视网膜母细胞瘤Y79细胞购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基、胰蛋白酶和青链霉素购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；MTT试剂、二甲基亚砜购自美国Sigma公司；miR-375 mimics及阴性对照NC mimics购自广州市锐博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Trizol试剂、逆转录试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；AnnexinⅤ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix试剂盒购自日本TaKaRa公司；细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒及Western blot相关试剂购自碧云天生物技术研究所；Pax6抗体、GAPDH抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Abcam公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司，实验所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 细胞培养及转染 人视网膜母细胞瘤Y79细胞采用含10%胎牛血清+ RPMI1640培养液培养，置37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养。根据细胞生长状态每2 d更换1次培养液，细胞贴壁生长密度在80%以上时，以胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Y79细胞铺板，过夜培养，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染Y79细胞，其中转染miR-375 mimics的Y79细胞记为miR-375组，转染NC mimics的Y79细胞记为NC组，同时设置未转染的Y79细胞为空白对照即Control组。转染后各组Y79细胞置37℃培养箱继续培养。

1.3 qRT-PCR检测miR-375和Pax6 mRNA相对表达水平 收集转染48 h的3组Y79细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，使用超微量核酸蛋白检测仪检测RNA纯度和浓度，按照逆转录试剂盒说明书合成cDNA，以合成的cDNA为模板使用SYBR Green PCR Master Mix试剂盒进行扩增，反应体系为：cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，去离子水7 μl。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算各组Y79细胞中miR-375相对表达水平，以GAPDH为内参，计算Pax6 mRNA相对表达水平。

1.4 MTT实验检测Y79细胞增殖活力 Control组、NC组和miR-375组Y79细胞接种到96孔板，接种密度为5×103个/孔，分别在转染0、24、48、72 h时在每孔细胞中加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，于37℃下孵育4 h，除去上清，再在细胞中加入150 μl二甲基亚砜，避光溶解10 min，使用酶标仪检测450 nm处吸光度值(A值)。

1.5 流式细胞仪实验检测Y79细胞凋亡情况 收集转染48 h各组Y79细胞，预冷的PBS洗涤3次，加入适量Binding buffer缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为3×105/ml，取500 μl;细胞悬液，在细胞悬液中加入AnnexinⅤ-FITC溶液10 μl，混匀后再加入PI染色10 μl，混匀后室温避光反应15 min，立即上流式细胞仪检测。

1.6 双荧光素酶报告基因实验 通过TargetScan在线软件预测miR-375的靶基因，发现Pax6 3’UTR区域与miR-375存在结合位点。根据生物信息学预测结合分别构建Pax6野生型(Pax6-Wt)和Pax6突变型(Pax6-Mut)的报告基因载体质粒，该步骤由上海生工生物工程有限公司完成。将对数期的Y79细胞种植在24孔板中，密度为1×105/孔，于37℃培养箱继续培养。待Y79细胞贴壁后，分别将Pax6-Wt和Pax6-Mut载体质粒分别与miR-375 mimics或NC mimics共转染Y79细胞，24 h后，使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别测定各组细胞萤火虫荧光素酶活性和海肾萤光素酶活性，统计细胞相对荧光素酶活性。

1.7 Western blot实验检测Y79细胞中Pax6蛋白表达水平 3组Y79细胞转染48 h后，分别收集细胞，加入适量细胞裂解液提取总蛋白，使用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度，行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白分离后转硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉封阻2 h，TBST洗膜3次，加入1∶1 000稀释的Pax6一抗，4℃孵育过夜，加入1∶3 000稀释的二抗，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，使用ECL化学发光试剂盒显影，转移至暗室曝光，在凝胶成像系统扫描，以GAPDH为内参，使用Image J图像分析软件分析条带灰度值，计算各组Y79细胞中Pax6蛋白相对表达水平。

2 结果

2.1 miR-375 mimics转染效率检测 将miR-375 mimics及其阴性对照转染至Y79细胞，采用qRT-PCR检测转染效率，结果显示，miR-375组Y79细胞中miR-375相对表达水平明显高于Control组和NC组(P<0.05)，Control组和NC组间miR-375相对表达水平相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 过表达miR-375可抑制Y79细胞增殖 MTT法检测各组Y79细胞增殖活力，结果显示，miR-375组24、48、72 h时Y79细胞A值显著低于Control组和NC组(P<0.05)，Control组和NC组间24、48、72 h时Y79细胞A值相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

组别miR-375Control组 1.00±0.11NC组 0.97±0.09miR-375组3.18±0.34*#F值106.451P值0.000

注：与Control组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05

组别0 h24 h48 h72 hControl组 0.21±0.020.38±0.040.62±0.060.88±0.09NC组 0.20±0.020.37±0.040.59±0.060.85±0.08miR-375组0.21±0.020.28±0.03*#0.38±0.04*#0.51±0.05*#F值0.2506.65917.48922.359P值0.7870.0000.0030.000

注：与Control组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05

2.3 过表达miR-375促进Y79细胞凋亡 流式细胞仪检测各组Y79细胞凋亡率，miR-375组Y79细胞凋亡率显著高于Control组和NC组(P<0.05)，Control组和NC组间细胞凋亡率相比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见图1,表3。

图1 流式细胞仪检测Y79细胞凋亡率

组别凋亡率Control组 6.02±1.13NC组 6.12±1.15miR-375组18.42±3.35*#F值33.106P值0.001

注：与Control组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05

2.4 miR-375靶向调控Pax6基因 通过生物信息学工具Targetscan预测结果显示，miR-375与Pax6基因3’UTR存在靶向结合位点。双荧光素酶报告基因实验结果显示，Pax6-Wt共转染组中miR-375细胞的相对荧光素酶活性明显低于NC组(P<0.05)，Pax6-Mut共转染组细胞的相对荧光素酶活性无明显改变(P>0.05)。qRT-PCR和Western blot检测结果显示，miR-375组Y79细胞中Pax6 mRNA和蛋白表达水平明显低于NC组(P<0.05)。见图2。

图2 miR-375靶向调控Pax6的表达

注：A：TargetScan软件预测miR-375与Pax6靶向结合位点；B：双荧光素酶报告基因实验检测Pax6是miR-375的靶基因；C：qRT-PCR和Western blot检测转染过表达miR-375对Pax6 mRNA和蛋白表达的影响;与NC组比较，*P<0.05

3 讨论

视网膜母细胞瘤发生和发展涉及多种因素，包括癌基因和肿瘤抑制基因的遗传和表观遗传改变，并且之前已经证明这些因子可调节细胞生长，细胞周期和细胞凋亡。研究显示，miRNA可能在癌症包括视网膜母细胞瘤中起着致癌基因或肿瘤抑制因子的作用，这取决于它们的靶mRNA[8]。miRNA参与多种生理和病理过程，包括细胞增殖，细胞周期，细胞凋亡，分化，血管生成，迁移，侵袭和转移[9]。miR-375位于染色体2q35上，越来越多的研究表明，miR-375在许多类型癌症中的表达水平下调，包括头颈部鳞状细胞癌，肝细胞癌和肺癌等[10,11]。在前列腺中，miR-375的表达显著下调，并且其低表达水平与肿瘤分期，组织学分级和淋巴结转移密切相关[12]。在结直肠癌中，与邻近的非肿瘤组织相比，miR-375在结直肠癌组织中的表达水平显著降低，体外功能探究实验显示，miR-375通过靶向sp1在转录后水平抑制sp1表达来抑制结肠直肠癌细胞的增殖[13]。miR-375在胃癌细胞中表达下调，miR-375的异位表达在体外和体内抑制肿瘤生长，miR-375通过靶向YAP1-TEAD4-CTGF轴参与该过程[14]。Cao等[15]研究发现，miR-375靶向血小板衍生生长因子-α抑制口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭。Venkatesan等人通过生物信息学分析以预测与视网膜母细胞瘤发病相关的miRNA，结果发现miR-375表达水平显著降低[16]。然而，目前关于miR-375在视网膜母细胞瘤中的作用及机制尚不清楚。本实验通过细胞功能实验发现，过表达miR-375能够抑制视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖，诱导细胞凋亡，本实验结果表明miR-375在人视网膜母细胞瘤中亦发挥抑癌作用。

鉴定miR-375靶基因对于了解其在视网膜母细胞瘤癌发生和发展中的功能以及探索视网膜母细胞瘤的新靶向疗法是必不可少的。在本研究中，证实了涉及miR-375靶向Pax6的分子机制。首先，通过生物信息学在线软件TargetScan预测Pax6是miR-497的潜在靶标。其次，通过双荧光素酶报告基因实验检测显示miR-375直接靶向Pax6 3'-UTR。最后，通过qRT-PCR和蛋白质印迹分析显示miR-375在mRNA和蛋白质水平下降低Pax6的表达水平。这些实验结果表明miR-375通过直接靶向Pax6抑制视网膜母细胞瘤的发生和发展。Pax6是PAX家族的成员，是与眼睛和中枢神经系统发育相关的重要转录因子[17]。目前已确定表达失调的Pax6涉及不同类型的人类癌症，包括胰腺癌、非小细胞肺癌、视网膜母细胞瘤、神经胶质瘤和结肠直肠癌等[18,19]。目前已证明PAX6受癌症中多种miRNA的调节。在骨肉瘤中，miR-19通过靶向Pax6促进体外骨肉瘤细胞的恶性表型[20]。miR-655通过直接靶向PAX6并抑制ERK和p38 MAPK信号通路，减弱视网膜母细胞瘤细胞的恶性生物学行为[21]。Zou等[22]报道显示，miR-375靶向Pax6并抑制人乳腺癌MCF-7细胞的活力，迁移和侵袭。本研究证实miR-375负调节Pax6的表达水平，抑制视网膜母细胞瘤的细胞增殖，促进细胞凋亡。总之，这些发现表明基于miR-375/Pax6的靶向治疗可能是视网膜母细胞瘤的新疗法。

总之，本研究揭示miR-375通过直接靶向Pax6显著降低视网膜母细胞瘤细胞中的细胞增殖能力，诱导细胞凋亡。实验结果表明miR-375通过靶向Pax6在抑制视网膜母细胞瘤的发生和发展中起重要作用，应作为视网膜母细胞瘤的潜在新型靶向治疗进行研究。