油茶蒲多糖的提取工艺优化及其抗氧化活性

李佳佳，罗思源，丁春邦，陈 涛，周莉君

(四川农业大学生命科学学院，四川 雅安 625014)

油茶(Camelliaoleifera)属山茶科山茶属植物，是我国特有的油料树种，具有悠久的种植历史，也是世界四大木本食用油料作物之一，主要利用其茶籽榨取茶油[1].茶油中含有丰富的不饱和脂肪酸和多种酚类化合物，营养价值丰富[2-3].由于其具有良好的抗氧化、防紫外辐射、免疫调节、降血糖等多种活性，被誉为“东方橄榄油”[4-5].

近年来，国家大力推进油茶产业的发展，经国务院批准颁布了全国茶油产业发展规划，规划提出，到2020年，全国油茶产量将达到250万t[6].但提取油脂后的副产物也随之增多，油茶蒲便是其主要的一个副产物.油茶蒲即油茶果壳，占油茶果湿重的60%以上，在油茶产业中常作为燃料或直接作为废弃物处理，未被有效利用.研究表明，油茶蒲中含有酚类、萜类、黄酮以及多糖等多种物质[7-9]，其提取物已被证实具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂以及减肥等功效[10-12].据报道，油茶蒲多酚对人体细胞DNA损伤有显著的保护作用[13]，其黄酮及皂苷类物质具有较好的抑菌作用[14-15]，但关于其多糖的活性却鲜有报道.目前关于油茶蒲多糖的研究主要集中在提取方面，且提取率相对较低[16].为了提高资源综合利用率，对油茶蒲多糖的提取工艺进行优化并探究其活性显得十分必要.

因此本实验以油茶果蒲为材料，对热水提取法提取油茶蒲多糖的工艺进行了优化，并探讨其体外抗氧化活性，旨在为保护环境、进一步提高油茶资源利用率提供参考.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油茶蒲：四川省荣县油茶基地提供，经四川农业大学生命科学学院丁春邦教授鉴定.

无水乙醇、石油醚、苯酚、硫酸、葡萄糖、DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)、PBS(磷酸缓冲液)、铁氰化钾、TCA(三氯乙酸)、三氯化铁、H2O2、水杨酸、硫酸亚铁、抗坏血酸均购自成都科龙试剂厂，所有试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

电子天平(BT-124S)：德国Sartorius公司；实验室超纯水机(RM-220)：四川沃特尔科技发展有限公司；台式冷冻离心机(Allegra X-15R)：贝克曼库尔特有限公司；高速冷冻离心机：美国Thermo Fisher公司；旋转蒸发仪(RE-2000B)：上海亚荣生化仪器厂；酶标仪(Specra Max M2)：美国Molecular Devices公司.

1.3 实验方法

1.3.1 材料预处理 将油茶蒲放于60 ℃恒温烘箱干燥4 d后，用粉碎机粉碎并过40目筛.将油茶蒲粉末放于索式提取仪中经石油醚(60～90 ℃)回流8 h脱脂后干燥备用.

1.3.2 油茶蒲多糖的提取与测定 称取预处理后油茶蒲粉末，按一定液料比加入蒸馏水，在相应温度下提取一定时间后6 000 r·min-1下离心10 min.采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品测定上清液多糖含量[17]，计算提取率.合并上清液，旋转蒸发浓缩，加入3 倍体积无水乙醇过夜沉淀，后离心取沉淀，冷冻干燥得粗多糖.计算公式为：

(1)

式中，C为样品多糖浓度μgmL-1；N为稀释倍数；V为样品体积，单位为mL；m为油茶蒲粉末质量(g).

1.3.3 单因素实验

1) 提取时间对多糖提取率的影响

2) 提取温度对多糖提取率的影响

3) 液料比对多糖提取率的影响

1.3.4 响应面实验设计 以单因素试验为基础，选取提取过程中对得率影响较大的变量因素最佳范围，采用中心组合试验法，设计液料比A(mLg-1)、提取温度B(℃)、提取时间C(min)为3个变量因素3水平的试验，每组试验重复4次，以茶蒲多糖提取率为响应值(Y)进行实验，实验设计如表1.应用Box-Behnken软件对响应面实验结果进行分析.

表1 响应面分析因素与水平Tab.1 Response surface analysis factors and levels

1.3.5 油茶蒲多糖体外抗氧化活性测定

1) DPPH自由基清除率测定

根据徐洲[18]等人的方法，略作修改测定油茶蒲多糖的DPPH自由基清除能力.取一定量的油茶蒲粗多糖用蒸馏水溶解为2.0 mgmL-1的母液，并稀释为0～2.0 mgmL-1相应浓度.取30 μL油茶蒲多糖溶液加入170 μL DPPH(0.4 mmol·L-1)乙醇溶液于96孔板中，黑暗处反应10 min，测定517 nm吸光值，计算DPPH自由基清除率，公式如下(阳性对照为Vc)：

DPPH自由基清除率(%)=(1-A1/A0)×100,

(2)

式中,A1为样品吸光值，A0为蒸馏水代替样品的吸光值.

2) 总还原能力测定

根据李粉玲[19]等人的方法，略作修改测定油茶蒲多糖的总还原能力.取0.2 mL多糖溶液，加入0.5 mL PBS(0.2 mmol·L-1)和0.5 mL铁氰化钾(1%，m/V)，混匀，于50 ℃水浴锅中孵化20 min.加入0.5 mL TCA (10%，m/V)后迅速冷却5 min，取0.5 mL 上层清夜加入0.5 mL蒸馏水和0.1 mL FeCl3(0.1%，m/V)混匀，在700 nm处测定吸光值，以多糖浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘制总还原能力图.以Vc做阳性对照.

1.3.6 数据处理 所有实验组均重复4次，以平均值±标准误差表示(Mean±SD)，采用Graphpad Prism 6.0对数据进行统计分析并作图.

2 实验结果与讨论

2.1 葡萄糖标准曲线

经由苯酚—硫酸法绘制葡萄糖标准曲线(图1)，其回归方程为：y=0.008477x+0.1027；R2=0.991.

图1 葡萄糖标准曲线Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 单因素实验结果

2.2.1 提取时间对多糖提取率的影响 由图2可以看出，多糖提取率在60 min到120 min内呈逐渐上升趋势，并在提取时间为120 min时达到最高值，之后略有下降后趋于平缓.表明在一定范围内增加提取时间可以提高多糖的提取率，但提取时间达到150 min后，多糖提取率相对降低，可能是由于时间过长，多糖结构被破坏而影响提取率[20].因此，结合多糖提取率以及省时的考虑，选择提取时间120 min为中心点进行响应面优化.

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extraction rate of polysaccharides

2.2.2 提取温度对多糖提取率的影响 由图3可知，在提取温度为60 ℃到80 ℃之间时，多糖提取率逐渐增加，在80 ℃以后多糖提取率略有下降.表明适当的热处理对提取效率起着正面的作用，较高的温度可以提高多糖的产量，但过高的温度会导致多糖水解[21].结合该提取结果以及节能的考虑，确定80 ℃为响应面中心点进行响应面优化.

图3 提取温度对多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 液料比对多糖提取率的影响 由图4可知，在液料比10 mL·g-1到30 mL·g-1条件下，多糖提取率没有明显变化，但当液料比大于30 mL·g-1后多糖提取率显著下降.可见当液料比低于30 mL·g-1时，多糖的提取率受影响较小.当液料比大于30 mL·g-1时提取率降低，有可能是因为溶剂过多，在一定的加热时间内，溶剂温度上升速度减慢，多糖未被充分浸出[22].因此，结合实验结果分析，确定30 mL·g-1作为中心点进行响应面优化.

图4 液料比对多糖提取率的影响Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the extraction rate of polysaccharides

2.3 响应面优化多糖提取

2.3.1 响应面设计结果 Box-Behnken试验设计及结果如表2所示.

表2 Box-Behnken试验设计及结果Tab.2 Box-Behnken test design and results

2.3.2 回归模型建立及方差分析 利用 Design-Expert 10软件对表2的结果进行多元回归拟合分析，得到拟合全变量二次回归方程：Y=10.39+0.66A+0.63B+0.12C+0.10AB+0.37AC-0.38BC-0.76A2-0.68B2-0.69C2.

2.3.3 响应面分析 采用Design Expert 10软件对实验数据进行可视化分析，并作出三维图和等高线图.利用三维响应面图形直观地展示回归方程，可以更深入地理解每个被测变量与响应之间的关系，以及任意两个变量之间的相互作用.二维等高线图可显示变量间的相互作用是否显著.椭圆等高线图表示变量之间的相互作用是显著的.相反，圆形等高线图表示变量间相互作用可以忽略不计.如图5与图7中等高线变化较为稀疏，而图6中等高线变化相对密集，说明提取时间与液料比的交互作用对多糖的提取率影响较大.

通过分析确定出最佳提取工艺条件为：提取时间150 min，提取温度为84.83 ℃，液料比为32.2 mLg-1，此时油茶蒲多糖得率理论值10.52%.为方便试验的实际操作，将最佳提取条件调整为液料比为32 mLg-1，提取时间150 min，提取温度为85 ℃，进行4次平行验证试验，在此条件下油茶蒲多糖的得率平均值为10.49 ± 0.21%.结果表明，经过响应面回归方程拟合出的理论值与实际值相差不大，与理论值符合，验证了方程的可靠性.且提取率相较于陈景斯[23]等人的乙醇提取工艺，增加了近一倍.

表3 方差分析结果Tab.3 Analysis of variance results

2.4 体外抗氧化活性

2.4.1 DPPH自由基清除能力 从图8中可见，油茶蒲多糖对DPPH自由基清除率最高为90 %，与Vc阳性对照相比，在0.5 mgmL-1浓度下，Vc对DPPH的清除率强于油茶蒲多糖，但当油茶蒲多糖浓度大于0.5 mgmL-1时，对DPPH自由基的清除率接近Vc对DPPH自由基的清除率.本次实验结果表明油茶蒲多糖也具有较强的DPPH自由基清除能力.

图5 提取时间和温度对多糖得率交互作用的3D响应面(a)和等高线(b)Fig.5 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and temperature to polysaccharide yield

图6 提取时间和料液比对多糖得率交互作用的3D响应面(a)和等高线(b)Fig.6 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction time and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

图7 提取温度和料液比对多糖得率交互作用的3D响应面(a)和等高线(b)Fig.7 3D response surface (a) and contour line (b) of interaction between extraction temperature and ratio of liquid-feed to polysaccharide yield

图8 多糖对DPPH自由基的清除能力Fig.8 The scavenging effect of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells on DPPH radical

2.4.2 总还原能力 从图中可以看出，随着油茶蒲多糖浓度的增加，其吸光值也随之增加.研究表明还原能力与抗氧化活性之间有密切关系[24].当浓度达到1.4 mg·mL-1时，在700 nm处吸光值高于1.3，与同浓度的Vc吸光值相近.显示出油茶蒲多糖通过自身的还原作用给出电子的能力(即还原力)较大，具有较强的抗氧化活性.并且随着多糖浓度的增加，其还原能力增强，符合浓度剂量效应.

图9 多糖的总还原能力Fig.9 The total reductive ability of polysaccharide from Camellia oleifera fruit shells

3 结论

本实验采用热水浸提法提取油茶蒲多糖，采用苯酚-硫酸法来测定多糖含量，具有操作简便、结果准确的优点.采用响应面法对油茶蒲多糖提取条件进行优化，以油茶蒲多糖含量为响应值，料液比、提取温度和提取时间为考察因素，建立二次回归模型，并采用Design-Expert软件进行数据处理分析.最终得出油茶蒲多糖的最优提取条件为液料比为32 mL·g-1，提取时间150 min，提取温度为85 ℃，油茶蒲多糖最高提取率可达到10.49±0.21%.经四次重复验证，该工艺合理，稳定可靠.体外抗氧化结果表明油茶蒲多糖能够较好的清除DPPH自由基，具有较强的总还原能力.本实验结果为油茶蒲多糖的进一步研究和开发提供了理论基础.