α-L-鼠李糖苷酶基因的重组表达及其应用

叶德晓，李慧灵，林育成，邓诚，陈宏基，周金林*

（1.广东金骏康生物技术有限公司，广东佛山 528225；2.佛山汇腾生物技术有限公司，广东佛山 528225）

α-L-鼠李糖苷酶（EC 3.2.1.40）是一类糖苷水解酶，主要属于GH13、GH28、GH78和GH106家族，能高效水解许多天然糖苷酶类化合物末端的鼠李糖基，如水解橙皮苷、柚皮苷、芦丁和槲皮苷等天然黄酮类糖苷化合物为橙皮素单葡萄糖苷、普鲁宁、异槲皮苷和槲皮素等。α-L-鼠李糖苷酶能应用于食品业中柑桔类果汁的去苦、饮料风味改善以及食品添加剂的生产等[1]。除了在食品领域的应用，α-L-鼠李糖苷酶还能应用于医药行业，如用于生产药物或者药物中间体以及对药物进行改性以提高药效等[2]。

橙皮苷在柑桔属的果皮中含量丰富，而我国是柑桔属果树种植和产量的第一大国，因此提高其综合利用率对增加产业附加值具有重大意义。橙皮苷溶解性极低，人体较难吸收，生物利用率低，表现出相对较弱的药理作用。研究表明，黄酮类化合物脱掉部分糖苷或者全部糖苷后，能被小肠更好地地吸收，以此来提高黄酮类化合物在人体的生物利用率[3]。利用α-L-鼠李糖苷酶将橙皮苷水解为橙皮素单葡萄糖苷，改善其溶解性，提高其生物利用率，可以加大其在食品和医药行业的运用范围；另外，橙皮素单葡萄糖苷在鼠李糖转移酶的催化下生成新橙皮苷，新橙皮苷是合成天然甜味剂NHDC的关键中间体，在酸橙中含量低，提取工艺复杂，成本高。因此，选用低成本的橙皮苷通过α-L-鼠李糖苷酶和鼠李糖转移酶转化得到新橙皮苷在合成NHDC的产业化上有重大价值。

将来源于T.petrophila的TpdRha基因进行分子克隆和异源表达，探究其水解橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷的活性，为后续研究酶转化新橙皮苷及NHDC奠定物质基础，能产生较好的社会价值。

1 材料与方法

1.1 材料

克隆宿主大肠杆菌Top10、表达宿主毕赤酵母GS115和毕赤酵母KM71H、表达载体pPIC9K均为实验室保存。实验所用酵母粉、蛋白胨、氯化钠、山梨醇、琼脂粉、琼脂糖、磷酸氢二钠和柠檬酸钠等试剂均为分析纯，购自生工生物工程（上海）股份有限公司；BIO-RAD MicroPulser 1652100型电转仪，购自美国BIO-RAD公司；Agilent 1100型高效液相色谱，购自安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 TpdRha序列分析

由CAZy数据库，获知6个已鉴定3D结构α-L-鼠李糖苷酶。在NCBI中获知其氨基酸序列，利用Clustalx软件进行氨基酸多重序列比对，再通过ESPript 3.0对比对结果进行渲染，最后用MEGA7软件制作分子进化树。

1.2.2 TpdRha基因克隆

根据TpdRha在NCBI数据库中公布的序列信息，利用密码子偏好性进行优化，依据优化结果进行合成，将其克隆至pPIC9K载体上。提取质粒pPIC9K-TpdRha，以质粒为模板，通用引物AOX进行PCR反应，产物经琼脂糖凝胶电泳检测，交由生工生物有限公司测序。

1.2.3 异源表达

利用SalⅠ酶线性化pPIC9K-TpdRha质粒，回收后将其电转化毕赤酵母GS115和毕赤酵母KM71H中。经过含G418的YPD培养基筛选，挑选单克隆裂解后以通用引物AOX进行PCR鉴定，将正确的阳性克隆命名为GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。

接种菌株到YPD培养基于30 ℃活化培养，1%的接种量至BMGY培养基，30 ℃培养OD600到2～6。室温离心，收集菌体，用BMMY重悬菌体，28 ℃诱导表达，每天加终浓度为0.5%的甲醇，维持诱导条件。诱导表达5 d，4 ℃离心，上清即为粗酶液。

1.2.4 TpdRha酶解橙皮苷

分别加入pH为4.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、橙皮苷混匀，加入粗酶液到混合后的橙皮苷溶液中，60 ℃恒温反应4 h，加入等体积的乙酸乙酯抽提，取上层有机相，经真空浓缩后，反应产物溶解于甲醇中，结果用HPLC检测。

2 结果与分析

2.1 序列分析

检索CAZy数据库，TpdRha属于GH78家族，具有876个氨基酸残基和糖基化位点，无信号肽序列，包含4个超家族保守结构域，其中Bac_rhamnosid_N可能与识别底物有关，另3个保守结构域与其生物活性相关。TpdRha与DtRha（ACI19983.1）序列同源性为46.25%；与SaRha78A（BAC68538.1）序列同源性为35.64%；与AtRha（AFH54529.1）序列同源性为31.86%；与RhaB（BAB62315.1）序列同源性为27.78%；与KoRha（AEX05711.1）序列同源性为24.52%；与BtRha（AAO76108.1）序列同源性为20.76%。多重序列比对结果显示Asp456、Trp466、Gly468、Asp469、Asp572、Trp573、Trp745、Glu746、Ser758和His761的氨基酸残基高度保守，其中Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物结合方面和生物催化活性上起到重要作用[4-5]。图1的系统发育进化树表明，TpdRha和DtRha进化关系相近，属于一个进化分支，研究报导DtRha具有水解橙皮苷为橙皮素单葡萄糖苷的活性[6]，为研究TpdRha的水解橙皮苷的活性提供了进化理论基础。

图1 TpdRha系统发育进化树

2.2 TpdRha基因克隆

将TpdRha克隆至pPIC9K载体上。图2A是使用AOX引物进行菌液PCR鉴定的结果，可以得到约2 800 bp大小的片段，测序正确。对构建成功的重组菌命名为Top10-pPIC9K-TpdRha，保留菌种，培养，提取质粒（图2B）。

图2 pPIC9K-TpdRha克隆及质粒提取

2.3 构建pPIC9K-TpdRha重组表达毕赤酵母菌

线性化pPIC9K-TpdRha质粒电转化至毕赤酵母GS115和KM71H中，得到的重组表达菌株分别命名为GS115-TpdRha和KM71H-TpdRha。挑选单菌落通用引物AOX进行菌落PCR鉴定。

图3为重组毕赤酵母菌液PCR鉴定结果。图3A结果显示GS115-TpdRha阳性菌株在2 200 bp出现AOX条带以及在2 800 bp左右出现目的基因条带，由于TpdRha基因大小为2 600 bp，当重组载体整合于GS115基因组后，TpdRha基因与pPIC9K两端序列同源臂结合，在PCR扩增时，目的基因将变成2 800 bp的片段。结果表明，TpdRha基因实现与毕赤酵母GS115基因组成功整合。

图3B结果显示KM71H-TpdRha阳性菌株只在2 800 bp左右出现目的基因条带，由于TpdRha基因大小约为2 600 bp，当重组载体整合于KM71H基因组后，TpdRha基因与pPIC9K两端序列同源臂结合，在PCR扩增时目的基因将变成2 800 bp的片段，而KM71H细胞本身不具有AOX基因，因此只出现一条条带。结果表明，TpdRha基因实现与毕赤酵母KM71H基因组成功整合。

图3 pPIC9K-TpdRha重组毕赤酵母鉴定

2.4 TpdRha酶转橙皮苷应用

重组表达菌株GS115-TpdRha和KM71HTpdRha经甲醇诱导表达后，分离得到粗酶液。以橙皮苷为底物进行反应，反应产物用HPLC进行检测。图4检测结果显示，GS115-TpdRha和KM71HTpdRha异源表达得到的粗酶液均对橙皮苷有水解活性，转化率分别为25.38%和36.64%，KM71HTpdRha表达得到的酶活相对更强。两种不同宿主表达出来的活性存在差异，推测与TpdRha在宿主的糖基化或表达量有关，其次与分泌表达后的降解率相关。对二者表现出的酶活差异，后续相关研究将采用KM71H-TpdRha重组菌进行优化发酵生产TpdRha，为其进一步应用于以橙皮苷为底物生产橙皮素单葡萄糖苷奠定基础。

图4 TpdRha异源表达活性检测

3 结论

α-L-鼠李糖苷酶在天然产物的转化应用中具有重大价值，从不同水平对其进行研究，可以为其在食品医药行业上的产业化应用提供理论基础。以可耐热生长的T.petrophila的α-L-鼠李糖苷酶为目标，对其氨基酸序列进行分析，发现其含有876个氨基酸残基，无信号肽序列，有糖基化位点和4个保守超家族结构域。序列比对显示TpdRha与DtRha同源性较高，为46.25%；多重序列比对结果显示TpdRha有10个氨基酸残基位点高度保守；经3D结构分析推测Asp456、Glu462、Asp469和Glu746在底物结合方面与生物催化活性上起重要作用；系统发育进化树结果显示TpdRha与DtRha属于同一个进化分支。