浊度法在金黄色葡萄球菌体外药物敏感性试验及耐药性分析中的应用

高铎，孔繁雪，韩镌竹，武凤娇，郭玉翠，李欣南*

（1.辽宁省检验检测认证中心，辽宁沈阳110000；2.沈阳药科大学，辽宁沈阳117004）

抗生素是目前治疗细菌感染的主要药物，其出现和使用为人类健康做出了不可磨灭的贡献，对动物疾病的预防与控制作用同样功不可没。但不规范用药则会引发畜禽的群体性危害，造成兽药残留超标、产生细菌耐药性和畜禽产品质量安全等问题。为了满足人类对动物性食品不断增长的需求，人们在畜禽养殖过程中常常大量使用抗生素类药物来预防动物性疾病并促进生长。抗生素的残留使得一些动物体内的细菌常暴露在抗生素环境中，体内的耐药菌株将会得到选择性增殖，使得抗生素的治疗效果下降[1-2]。

金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属（Staphylococcus），是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染，是临床上重要的致病菌，特别是超级细菌-耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现及其耐药性的快速增长，使其成为全球内感染的首要病原菌。金黄色葡萄球菌常引起两类疾病：（1）化脓性疾病，主要引起动物的乳房炎、关节炎等，可通过动物传递给人类；（2）毒素性疾病，会引起人和动物的中毒性呕吐等，严重威胁人类的食品安全和公共卫生[3-6]。

微生物比浊法能直观地反应抗生素总的抗菌能力[7-8]，因此利用该原理，本文选择了庆大霉素、红霉素、氧氟沙星3种不同类型的药物，实时测定并绘制时间-吸光度抑菌生长曲线，以此分析3种药物在不同浓度下、不同时间节点上与细菌相互作用的关系，旨在为药效学的研究、解决细菌耐药性及指导临床合理使用抗生素提供数据和试验参考。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213，购自北京兰伯瑞生物技术有限责任公司；实验菌株DX1、XNC22于养殖场中分离获得。

1.2 仪器

CLASS Ⅱ生物安全柜，购自美国NUAIRE公司；全自动高压灭菌器，购自日本三洋电器集团；恒温培养箱，购自德国BINDER公司；VITEK 2 Compact 全自动细菌鉴定及药敏分析系统，购自BIOMERIEUX公司；WBS-100微生物比浊法测定仪，购自北京先驱威锋技术开发公司。

1.3 培养基与材料

抗生素检定培养基3号，购自北京中海生物科技有限公司；营养琼脂，购自北京陆桥技术有限责任公司；革兰氏阳性菌鉴定卡（GP鉴定卡），购自BIOMERIEUX公司；标准品购自中国兽医药品监察所或中国食品药品检定研究院。

1.4 方法

1.4.1 菌悬液的制备

根据美国临床和实验室标准化研究所（CLSI，Clinical and Laboratory Standards Institute ）对菌悬液浓度的要求[9]，来稀释菌悬液。将保存的菌种接种于配制好的营养琼脂培养基中，置于37℃培养箱中培养24h后取出待用，在生物安全柜中，用棉签取单菌落于装有0.85%灭菌生理盐水的安瓿瓶中，用麦氏比浊仪将试验菌液浓度调节为0.5麦氏（0.5麦氏菌悬液的浓度约为1.5×108cfu/mL），后进一步稀释至5×105cfu/mL，备用。

1.4.2 储备药液的制备

将庆大霉素、红霉素、氧氟沙星标准品分别溶解并稀释成2048μg/mL的抗生素贮存液。配制的药液以质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC®29213进行质控，其最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）值在CLSI允许的范围内。

1.4.3 微量稀释法-药物敏感性试验

采用CLSI指定的微量稀释法，进行药物敏感性实验[9]。取稀释至5×105cfu/mL浓度的菌液0.1mL分别加入含系列抗菌药物溶液的板中，混匀使试管中最终抗菌药物的浓度为原稀释浓度的50%，并设置阳性对照和阴性对照。将加有菌液和抗菌药物的板置37℃培养箱中培养18～20 h。观察记录结果，以无菌生长的最低抗菌药物溶液的浓度为MIC值。判定标准参照CLSI标准，具体见表1，按判断标准判断被检菌株的敏感性为敏感（S），中度敏感（I）或耐药（R）。

1.4.4 浊度法-体外药物敏感性试验

根据质控菌和试验菌的微量稀释法-药物敏感性试验获得的MIC值，分别用水稀释成4个不同的药物浓度，备用。向比浊管中按拉丁方排列加入配制好的系列浓度药物1.00mL，再加入9.00mL适宜浓度的菌悬液，使菌液终浓度为5×105cfu/mL，药物终浓度分别为MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC。

表1 金黄色葡萄球菌药敏判定标准和质控范围

表2 不同药物浓度拉丁方排列方式

将添加有不同浓度药物、菌液混悬液的比浊管放入到WBS-100微生物比浊法测定仪中，培养温度为37℃，监测间隔时间为30min，监测时长为16h，测定实时吸光度。试验结束后通过不同时间节点的吸光度值使用Excel绘制其时间-吸光度抑菌生长曲线。

2 结果与分析

如表3所示，微量稀释法-药物敏感性试验测得的MIC结果与浊度法测得的结果无显著差异，但浊度法试验为实时吸光值信号采集，获得的结果可能更接近实际的MIC值，而通过时间-吸光度曲线进行MIC终点判读则更直观和准确。

如图1所示，3种药物的分离菌株生长曲线都是前期呈不断增长的趋势，到后期明显逐渐下降，而质控菌株呈现增长的趋势，下降趋势不明显；不论是分离菌株还是质控菌株，呈现的生长曲线的1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC曲线下面积不同；1/8MIC先于1/4MIC进入对数生长期，1/4MIC先于1/2MIC进入对数生长期；红霉素、庆大霉素的分离菌1/2MIC先于质控菌1/2MIC进入对数生长期；氧氟沙星为快速杀菌剂，其1/2MIC进入对数生长期较红霉素和庆大霉素早。红霉素为时间依赖型抗生素，其抑菌时间比庆大霉素和氧氟沙星都要长。。

通过红霉素、庆大霉素和氧氟沙星3种药物的时间-抑菌生长曲线分析，可以发现金黄色葡萄球菌在亚抑菌浓度（1/2 MIC）的压力下，其生长趋势呈现了不同于理论设想的情况，可能并非是细菌抑制或杀死其生长量绝对值的一半。

表3 3种抗菌药物对金黄色葡萄球菌的MIC

图1 金黄色葡萄球菌在3种抗菌药物作用下的时间-吸光度曲线

图2 质控菌株ATCC29213在3种抗菌药物作用下的时间-吸光度曲线

3 讨论与结论

已有研究表明，亚抑菌浓度下细菌耐药基因的水平传播可能性增加，突变株数量大于野生株数量，还会形成生物膜，这些都可导致耐药性的产生，而亚抑菌浓度的药物压力下，耐药菌株还会被选择性富集，因此亚抑菌浓度下细菌与药物的作用关系很有研究价值[10-12]。不同药物浓度下金黄色葡萄球菌进入对数生长期的时间有显著差异，高浓度药物下的金黄色葡萄球菌进入对数生长期较低浓度药物有一定的延迟，目前还不明确金黄色葡萄球菌在亚抑菌浓度下是否会蓄积不同耐药机制的耐药菌株，即药物压力下快速进入对数期的细菌可能为获得耐药性的细菌。但也有研究证实，发生突变的高水平耐药菌的适应性与其亲本株相比大多数出现适应性下降[13]；耐药金黄色葡萄球菌的生长曲线呈现先增长后减小的趋势；浊度法下的时间-抑菌生长曲线可清楚地对不同依赖型药物的抑菌杀菌时间进行可视化判定，庆大霉素、氧氟沙星为浓度依赖型，可见不同药物浓度对细菌生长繁殖影响较大，而红霉素为时间依赖型，随着时间的延长，不同药物浓度的抑菌时间均比庆大霉素、氧氟沙星长，提示时间依赖型药物的抑菌时间均比浓度依赖型药物长。

浊度法较微量稀释法比较具有5点优势：（1）浊度法可以进行实时监控，测定其实时吸光值，反映金黄色葡萄球菌生长的动态趋势，微量稀释法只能在第2 d观察结果；（2）浊度法可以使用现有的浊度分析仪，实现自动化数据采集；（3）浊度法结合振摇培养，保证了药物与细菌的充分作用；（4）浊度法终点判读时更直观；（5）浊度法可清楚地对不同依赖型药物的抑菌杀菌时间进行可视化判定。

通过红霉素、庆大霉素和氧氟沙星3种药物的时间-抑菌生长曲线分析，金黄色葡萄球菌在亚抑菌浓度（1/2 MIC）的压力下，可能并非是细菌抑制或杀死其生长量绝对值的一半；不同药物浓度下金黄色葡萄球菌进入对数生长期的时间有显著差异，高浓度药物下的金黄色葡萄球菌进入对数生长期较低浓度药物有一定的延迟；耐药金黄色葡萄球菌的生长曲线呈现先增长后减小的趋势；随着时间的延长，不同药物浓度的红霉素抑菌时间均比庆大霉素、氧氟沙星长。