HPLC测定替米沙坦片含量方法学验证
2020-05-18陈晓春蒋玲彭奎毓张立仁张朝侠
陈晓春，蒋玲，彭奎毓，张立仁，张朝侠
（江苏万邦生化医药股份有限公司，江苏徐州 221004）
替米沙坦是一种口服非肽类血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，其脂溶性强，半衰期长，副作用较小，患者耐受性高，此外还可以选择性的激动过氧化物酶增殖物激活受体，改变左心室肥厚、改善胰岛素抵抗、保护血管内皮功能，是国内增长速度很快的沙坦类药物。替米沙坦片由德国Beohringer Ingelheim公司研制开发，规格为40 mg/片和80 mg/片，于1999年首次在美国上市。替米沙坦半衰期为18～24 h，药效作用时间可达35 h，可有效控制24 h血压，符合1天1次的用药标准[1]。本文建立一种快速、准确的高效液相色谱法，可有效测定替米沙坦片的含量，并对该方法进行验证。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
Agilent1200 VWD高效液相色谱仪（安捷伦公司）； LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；XS105型电子分析天平（梅特勒-托利多国际有限公司）；Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，Inertsil®ODS-SP色谱柱。
替米沙坦对照品，中国食品药品检定研究院，批号100629-150707；替米沙坦片，万邦医药，批号16037021；色谱纯甲醇（德国默克公司）、超纯水、磷酸二氢铵（国药集团）、磷酸（国药集团）。
1.2 含量测定方法
日本药典JP16第二增补本采用高效液相色谱法测定替米沙坦片含量；本研究依据日本药典方法拟定高效液相色谱法测定本品含量，具体操作如下。
色谱条件：色谱柱（Inertsil®ODS-SP，4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相为0.2%磷酸二氢铵溶液（用10%磷酸溶液调pH值至3.0）和甲醇，比例为30∶70；检测波长为295 nm，柱温为40 ℃，流速1.0 mL/min，进样量10 μL，替米沙坦主峰约6 min。
系统适用性试验：取对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，以替米沙坦峰计，理论塔板数不少于3 000，拖尾因子不超过2.0，对照品溶液重复进样6针，以替米沙坦峰计相对标准偏差不得过1.0%。
供试品制备：取替米沙坦片不少于20片，研磨，取细粉适量（约相当于替米沙坦80 mg），加50%甲醇溶解并定容稀释制成浓度为80 μg/mL的溶液。
对照品溶液制备：精密称定替米沙坦对照品20 mg置于25 mL量瓶中，加10 mL的2%葡甲胺溶液和适量50%甲醇溶解并定容稀释，摇匀，精密移取该溶液5 mL置于50 mL量瓶中，用50%甲醇定容，制成浓度为80 μg/mL的溶液。
1.3 方法学验证
1.3.1 专属性考察
原料溶液：按照对照品配制方法配制80 μg/mL替米沙坦的原料溶液。空白辅料溶液：按照处方比例配制空白辅料，称取混合粉末约2片空白辅料重量后按照供试品溶液配制方法配制成空白辅料溶液。分别取溶剂、对照品溶液、原料溶液、空白辅料溶液和供试品溶液，按照高效液相色谱法采用PDA检测器在190～450 nm波长处进行全波长扫描。
1.3.2 滤膜吸附试验
将供试品储备液（浓度为0.8 mg/mL）经0.45 μm微孔滤膜（有机系）过滤，取5 mL续滤液置50 mL量瓶，加溶剂稀释至刻度，摇匀；同法制备离心样品，即将滤膜处理换成离心处理（4 000 r/min，10 min）。将经滤膜和离心处理的供试品溶液注入高效液相色谱仪中，按照1.2中色谱条件进样分析，记录响应峰面积。
1.3.3 线性与范围
精密称定替米沙坦对照品约20 mg置于25 mL量瓶中，加0.2%葡甲胺溶液，振摇使溶解，精密量取续滤液0.5 mL、2.5mL、4 mL、5 mL、8 mL分别置于50 mL量瓶中，用溶剂定容至刻度，摇匀即得，精密量取各供试液10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。
1.3.4 重复性试验
取本品（批号16037021）按照1.2中供试品制备方法，平行配制6份供试品溶液，进样记录色谱图，按外标法计算替米沙坦片含量。
1.3.5 中间精密度试验
不同人员按照重复性的方法，在不同时间、不同仪器对同一批供试品溶液进样分析。
1.3.6 准确度（加样回收率）
精密称取替米沙坦原料约64 mg、80 mg、96 mg分别置100 mL量瓶中，再分别称取空白辅料约2片量，加溶剂适量，超声溶解15 min，放冷，加溶剂稀释至刻度，摇匀，经微孔滤膜（有机系0.45 μm）过滤即得，平行3份。按照含量测定项的方法，分别精密吸取配制好的对照品溶液和3种浓度（80%，100%，120%）的9份供试品溶液各10 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，计算回收率及RSD值。
1.3.7 溶液稳定性
取重复性项下的对照品溶液、供试品溶液分别在0 h、1 h、2 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h 进样分析。记录色谱图，计算峰面积，考察对照品溶液和供试品溶液放置过程中的稳定性，结果以峰面积计算RSD。
1.3.8 耐用性
取供试品和对照品溶液10 μL注入液相色谱仪，分别在柱温±5 ℃、波长±5 nm、流速±0.2 mL/min，流动相比例±3%，流动相pH±0.2条件下采用2种色谱柱（色谱柱 1：Inertsil®ODS-SP，4.6 mm×150 mm，5 μm；色谱柱 2：Agilent Eclipse XDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm）进行试验，记录色谱图。以替米沙坦峰计，理论塔板数不少于3 000，拖尾因子不超过2.0，对照品重复进样6针，以替米沙坦峰计相对偏差不得超过1.0%。按外标法得到含量，计算RSD值，考察本法的耐用性。
1.3.9 供试品含量测定
按照上述含量方法，测定3批供试品（批号分别为16037011，16037021，16037181）中替米沙坦的含量。
2 试验结果
2.1 专属性考察结果
对照品溶液、原料溶液和供试品溶液中均在297 nm波长处有最大吸收，且主峰保留时间一致（如图1、图2所示），溶剂和空白辅料对替米沙坦峰无干扰，表明该方法专属性较好。
图1 对照品、供试品和原料紫外吸收图谱
图2 对照品、供试品和原料液相图谱
2.2 滤膜吸附结果
滤膜吸附结果如表1所示，结果表明分别经过滤和离心的供试品峰面积几乎无差异，表明滤膜对产品没有吸附。
表1 滤膜吸附试验
2.3 线性与范围
以浓度（C）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，进行回归分析，线性图如图3所示；线性方程为y=30976.7.2x-12809.9，r2=0.999 8。结果表明本品在8～96.0 μg/mL的浓度范围内线性关系良好。
图3 替米沙坦线性图
2.4 重复性试验结果
重复性试验结果如表2所示，结果表明6份供试液含量相对标准偏差为0.21%，表明该方法重复性较好。
表2 重复性试验（批号16037021，n=6）
2.5 中间精密度试验结果
重复性试验如表3所示，结果表明两人测得含量RSD为0.75%，小于2%，表明该方法精密度良好。
表3 重复性试验（批号16037021，n=6）
2.6 准确度（加样回收率）
回收率试验结果如表4所示，结果表明该方法含量测定准确度良好。
2.7 溶液稳定性结果
对照品溶液在24 h内RSD=0.19%，供试品溶液在24 h内RSD=0.12%，表明对照品和供试品溶液均具有良好的稳定性。
2.8 耐用性结果
耐用性结果见表5，结果表明在柱温±5 ℃、波长±5 nm、流速±0.1 mL/min、流动相比例±3%、流动相pH±0.2及不同型号色谱柱等条件下，替米沙坦主峰的拖尾因子和理论塔板数没有明显的变化，含量的RSD值小于1.0%，说明该方法的耐用性良好。
表4 回收率试验结果
表5 不同色谱条件下替米沙坦含量测定
2.9 含量测定
批号为16037011、16037021和16037181的3批供试品检测结果分别为101.1%、100.8%、99.3%，差异不大。
3 结论
参照日本药典JP16第二增补本，采用高效液相法进行替米沙坦含量测定，并进行了方法学考察，包括波长选择、专属性、线性、精密度、稳定性、重复性、回收率和耐用性试验等。结果表明，该方法能准确测定本品含量，且专属性高。
