响应面分析法优化吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱的超声提取工艺

谢妍龙，李敏

（江西省医药学校，江西南昌 330200）

中药吴茱萸为芸香科植物吴茱萸及其变种石虎和疏毛吴茱萸的干燥近成熟果实[1]。其主要成分有生物碱、苦味素、挥发油、萜类、黄酮、香豆精、甾体和木脂素多糖等，其中生物碱和柠檬苦味素为主要有效成分，而吴茱萸碱（Evodiamine，Evo）和吴茱萸次碱（Rutaecarpine，Rut）是含量较多的生物碱[2]。吴茱萸碱具有抗肿瘤、强心、降压、舒张血管、抗炎、镇痛及减肥等药理作用[3-6]，吴茱萸次碱归属于喹唑啉酮咔啉类生物碱，具有广泛的药理作用，可以降血压、松弛血管、抗伤害感染、抗血小板聚集及抗缺氧，还可用于利尿、发汗、强心、抗炎镇痛及抗癌等方面[6-10]。

通过试验比较了传统和现代辅助提取技术，对吴茱萸生物碱的提取条件进行了深入考察分析，研究在提取过程中目数、超声功率、提取时间、提取温度和液固比等对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率的影响，在此基础上采用响应面法对超声波提取影响因素进行优化，得出吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：药材吴茱萸，购于江西药都樟树天齐堂中药饮片有限公司。

试剂：蒸馏水（用于分析）、二次蒸馏水（用于色谱分析）为自制；石油醚、乙酸乙酯，95%乙醇、甲醇、甲醇（色谱纯）购于天津市大茂化学试剂厂；氯仿、乙腈（色谱纯）购于西陇化工股份有限公司；吴茱萸碱标准品、吴茱萸次碱标准品购于陕西森弗生物技术有限公司。

仪器：FZ102型微型植物粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；RES2CS-2旋转蒸发器（上海申生科技有限公司）；KW-600DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（上海实验仪器厂）；KDC-160HR高速冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司）；Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（Agilent仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 工艺流程

前处理：吴茱萸经过干燥、粉碎后分别过20目、40目、60目、80目和100目筛，得到20～40目、40～60目、60～80目、80～100目以及大于100目的5个等级粒度，分别记作20目、40目、60目、80目、100目粒度的吴茱萸。然后用10∶1的石油醚超声（40 min、40 ℃、420 W功率）脱脂，反复8次，干燥后备用[11]。

提取流程：取脱脂干燥后的吴茱萸粉末1.0 g置于50 mL的离心管中，加入适量的溶剂，称重，在一定的条件下超声提取，补充溶剂至提取前重量，然后离心取上清液，用注射器抽取一定量的上清液，过0.45 μm的滤膜，用高效液相色谱仪检测含量，计算得出提取率。

1.2.2 吴茱萸碱和吴茱萸次碱HPLC测定的色谱条件

色谱柱：Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇∶乙腈∶水=20∶38∶42；流速：1.0 mL/min；检测波长：225 nm；柱温：25 ℃[12-14]。

采用Agilent 1100 Series高效液相色谱仪测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱标准品时得到两者的紫外吸收图谱，如图1所示。

图1 吴茱萸碱（a）和吴茱萸次碱（b）标准品紫外吸收图谱

1.2.3 Evo和Rut标准曲线的制作[15]

精密称定Evo标准品89.5 mg和Rut标准品7 4.0 mg，加甲醇定容至200 mL的容量瓶中，摇匀，取5 mL稀释10倍至50 mL容量瓶中，配成Evo浓度为44.75 mg/L、Rut浓度为37.00 mg/L的对照品溶液，分别进样 1.0 μL、2.0 μL、3.0 μL、4.0 μL 和5.0 μL，每个样重复3次，进行HPLC分析。记录峰面积，绘制标准曲线，得Evo回归曲线y=7 900.3x-13.38，相关系数R2=0.999 9，线性范围为0.044～0.224 μg；Rut回归曲线y=4 965.7x-8.41，相关系数R2=0.999 9，线性范围为 0.037～0.185 μg。

1.2.4 单因素实验

分别以不同的溶剂、原料目数、液固比、超声波功率、提取时间以及提取温度为单因素进行试验，考察各单因素对吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取得率的影响，提取次数均为1次。

1.2.5 Box-Behnken试验

根据单因素试验结果，从6个单因素实验结果中选取对提取过程影响较大的3个因素，采用经典的三水平三因素Box-Behnken试验设计来优化这3个因素[16-17]，以Evo和Rut提取率之和为指标进行分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 溶剂的选择

分别选取氯仿、乙醇、甲醇和乙酸乙酯作为提取溶剂，取20目脱脂后的吴茱萸在液固比30∶1，温度40 ℃、功率420 W条件下超声提取30 min，然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图2所示。由图2可以看出吴茱萸碱在乙醇溶剂中的提取率最高；吴茱萸次碱在甲醇溶剂中的提取率最高。对吴茱萸碱而言，乙醇提取率比甲醇提取率高0.48%，对吴茱萸次碱而言，甲醇提取率比乙醇提取率高1.00%；若以吴茱萸碱和吴茱萸次碱提取率总和作为指标，甲醇的提取率最高。这与笔者以前测定的溶解度数据[18-19]不相符，可能有两个原因：（1）超声波能够降解氯仿[20-21]；（2）在提取过程中，吴茱萸中的其他成分也会被提取出来，并且与氯仿和乙酸乙酯发生相互作用，从而使其溶解吴茱萸碱和吴茱萸次碱的量减少，导致提取得率低。故选择甲醇作为提取溶剂，提取效果好。

图2 溶剂对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

2.1.2 原料目数的影响

分别选取脱脂后20目、40目、60目、80目和100目的吴茱萸，以甲醇为溶剂在液固比30∶1、温度40 ℃、功率420 W条件下超声提取30 min，然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图3所示。不同目数对Evo和Rut提取率影响规律不同。Evo呈U型变化，两头高中间低，较高提取率的目数为20和100目；Rut的变化规律呈波浪形变化，即波峰波谷交替，最高提取率为60目；两者提取率之和为斜下的波浪形，最高提取率是20目。猜想造成此结果的原因是脱脂过程反复，吴茱萸碱和吴茱萸次碱长时间超声过程中呈游离状态损失，粒度越小，损失量就越多。为验证猜想的正确性，增设脱脂前目数对生物碱提取率影响实验，结果如图4所示，目数越大提取率越高，脱脂过程影响提取率，与上述分析吻合。故选取20目为单因素的最佳提取目数。

图3 目数对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

图4 脱脂前目数对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

2.1.3 液固比的影响

选取脱脂后20目的吴茱萸，分别以液固比为20∶ 1、30∶ 1、40∶1、50∶1、60∶1，以甲醇为溶剂在温度40 ℃、功率420 W条件下超声提取30 min，然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图5所示。Evo和Rut提取率总和变化趋势为：随着液固比增大，提取率逐渐升高，在50∶1的液固比条件下达到最高，随后60∶1的液固比提取率略有下降。这是由于溶剂的用量越大，有效成分在植物组织与溶液本体之间的浓度差就越大，越有利于传质的进行，但当溶剂用量达到一定程度后，提取率增加缓慢或略有减少，可能的原因是溶剂过多吸收大量的超声波能量，使得超声波到达固体基质时衰减至很弱。根据实验结果，50∶1（mL/g）为单因素的最佳液固比。

图5 液固比对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

2.1.4 提取温度的影响

选取脱脂后20目的吴茱萸0.5 g，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃温度下，以甲醇为溶剂、液固比50∶1、功率420 W的条件超声提取30 min，然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图6所示。由图可知，随温度的提高，Evo和Rut的提取率升高，但升高至50 ℃后，随着温度的升高，提取率下降。这是由于两者在温度高于60 ℃时不稳定，温度大于60 ℃，Evo和Rut的提取率下降。故选取50 ℃为单因素的最佳提取温度。

图6 提取温度对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

2.1.5 超声功率的影响

选取脱脂后20目的吴茱萸0.5 g，分别在超声功率为300 W、360 W、420 W、480 W、540 W，以甲醇为溶剂、液固比50∶1、50 ℃为条件提取30 min，然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图7所示。随着功率的增大，Evo和Rut的提取率逐渐增大，在功率达到420 W时，两者的提取率达到最大，随后减小。图8为吴茱萸脱脂后及超声提取后的扫描电镜图，由图可知，超声后吴茱萸细胞均被破坏，故超声功率太大导致提取率反而降低的原因可能是超声波空化作用和机械作用有利于吴茱萸碱和吴茱萸次碱的溶出，但若功率太大，Evo和Rut很快达到溶解平衡点，其他杂质成分溶出也越多，阻碍了Evo和Rut的溶出。故选择功率420 W为单因素的最佳超声功率。

图7 超声功率对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

图8 吴茱萸的扫面电镜图（SEM）

2.1.6 提取时间的影响

选取脱脂后20目的吴茱萸0.5 g，以液固比为50∶1（mL/g），提取温度50 ℃，超声功率为420 W为条件，分别用超声波提取20 min、30 min、40 min、50 min和60 min。然后用高效液相色谱仪检测含量，计算出得率，结果如图9所示。随着提取时间的增加，Evo和Rut的提取率逐渐增大，在50 min达到最高，60 min提取率略有下降。这是因为随着时间的增长，Evo和Rut溶解出越多，直到提取时间为50 min左右，溶剂内生物碱有效成分基本达到平衡，随着提取时间的增加，吴茱萸其他黏性杂质（如多糖成分）溶出，将Evo和Rut粘在吴茱萸固体基质上，从而提取率略有下降。故选取50 min为单因素的最佳提取温度。

图9 提取时间对吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱得率的影响

2.2 响应面法实验设计和实验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果

从5个单因素实验结果中选取对提取过程影响较大的3个因素：提取温度、提取时间、液固比。采用经典的三水平三因素Box-Behnken试验设计来优化这三个因素，在单因素实验的基础上，精密称取20目脱脂后的吴茱萸粉末0.5 g置于50 mL离心管中，选取提取温度（A）、提取时间（B）、液固比（C）在超声功率420 W条件下对吴茱萸碱和吴茱萸次碱的提取工艺进行优化，以Evo和Rut提取率之和为指标进行分析。具体实验方案见表1。

表1 响应面试验设计及结果分析

利用Design-Expert软件对表2实验数据进行二次多项式逐步回归拟合，得到的数学模型为：

模型方差分析结果和各项系数显著性检验结果列于表2。

表2 回归模型各项方差分析

由表2可知，模型的F=8.19、P=0.0161＜0.05，说明实验所采用的二次模型是很显著的。回归方程中各变量对响应值影响的显著性由F检验来判定，P值越小，则相应变量的显著程度越高。PA、PB、PA2、PB2、PC2均小于0.05，说明提取温度、提取时间以及3个因素的二次项都具有显著影响；而液固比和他们的交互项及缺失项显著性较差，也说明三者的交互作用不大。决定因素R2=0.936 5，也说明模型能够很好地反应响应值的变化，拟合度好。由各P值可见，提取温度和提取时间影响高度显著，而液固比较不显著。在所选取的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序，其顺序为提取温度＞提取时间＞液固比。

2.2.2 响应面分析及最优提取工艺参数的确定

运用Design-Expert软件分析处理实验所得数据，对提取率有交互影响的响应面分析立体曲面图见图10。由图可知，当提取时间和液固比都固定时，提取率随提取温度的变化幅度较大；当提取温度和液固比固定时，而提取率随着提取时间变化幅度也比较大；当提取时间和提取温度固定时，提取率随着液固比变化幅度较小，所以，提取温度和提取时间对提取率的影响都较为显著。通过最优化分析，最佳的提取条件为提取温度50.77 ℃、提取时间52.19 min、液固比50.73∶1（mL/g），预测提取率为2.529 mg/L。但考虑到实际操作的局限性，将吴茱萸生物碱的提取工艺修正为提取温度51 ℃、提取时间52 min、液固比51∶1（mL/g）。

3 验证试验

为了检验模型预测的准确性，在最佳提取条件：提取温度51 ℃、提取时间52 min、液固比51∶1（mL/g）下提取，实验得出Evo和Rut的最大提取率之和为2.456 mg/g，与理论值2.529 mg/g相比相对误差为2.88%，相差不显著。这说明模拟方程与实际情况符合得很好，响应面法能较好地对影响吴茱萸生物碱的超声提取工艺进行回归分析和条件优化。

4 结论

Box-Behnken试验设计和响应面（RSM）分析法建立吴茱萸中Evo和Rut提取工艺中提取温度、提取时间和液料比与总得率之间的回归模型，通过检验模型显著，可用于生产预测。实验得到的吴茱萸中Evo和Rut的提取最佳工艺参数为：溶剂为甲醇、目数为20目、超声功率为420 W、提取温度为51 ℃、提取时间为52 min、液固比为51∶1（mL/g），提取率预测值为2.529 mg/g，验证值为2.456 mg/g，与预测值的相对误差为2.88%。