连续股神经阻滞对KOA模型的疼痛治疗效果及可能的作用机制

2020-05-18秦国华

生物化工 2020年2期

秦国华

（山西医科大学晋祠学院，山西太原 030025）

神经阻滞疗法是当前一个新的阻断疼痛恶性循环研究方向，可阻断疼痛传导途径，改善血液流变学以及抗炎作用[1]。近年来，椎管内阻滞所带来的恶心呕吐等并发症，使其临床应用受限。有学者[2]认为连续股神经阻滞所起到的镇痛效果与椎管内阻滞相同，且恶心、呕吐等不良反应发生率较低。但其具体作用效果仍存在争议，对疼痛的缓解机制仍需研究。本研究基于膝骨性关节炎（KOA）模型，分析连续股神经阻滞对疼痛的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选择35只健康日本大耳白兔（浙江大学医学院动物实验室购买），雌雄不限，体质量2.7～3.6kg，兔龄为6个月；随机分为7组，（分组与国际疼痛研究联合会相关指南相符合），即空白组、模型组及实验组（实验1组、2组、3组、4组及5组），每组5只。

1.2 试剂与设备

试剂：盐酸罗哌卡因注射液（10 mL/支，医用），白介素（IL-1）、IL-6、肿瘤坏死因素-α（TNF-α）检测试剂盒（美国zymed公司生产，产品批号201004）；鼠抗兔MMP-3抗体、TIMP-1抗体（一抗，北京博奥森生物公司）；大鼠大步法检测试剂盒（二抗试剂盒，批号K97722B，中杉金桥公司）；20%木瓜蛋白酶溶液（稀释4%处理，郑州贺鑫生物科技有限公司）；3%双氧水；生理盐水；DAB显色试剂盒；高效切片石蜡（上海华永石蜡有限公司）；乌拉坦、注射用青霉素钠、利多卡因（医用注射剂）；苏木精、酒精、福尔马林、伊红（上海蓝季科技股份有限公司）。

设备：工作台（成都福莱特实验设备有限公司生产，通用型）、倒置相差显微镜（上海普赫光电科技有限公司生产，OLYMPUS奥林巴斯显微镜BX43）、医用微波炉（美的（Midea）M3-L232F）、温箱（上海朋闻塑料制品有限公司生产，425 mm×450 mm×420 mm）、湿盒（南通市卫宁实验器材有限公司生产，亚克力载玻片湿盒）；5 mL针筒、离心机（江苏华铖宝亿机械有限公司生产，卧式螺旋卸料沉降）、手术器械包（上海玉研科学仪器有限公司生产，玉研牌）、高压蒸汽消毒锅（浙江新丰中友生产，“中友”牌消毒灭菌锅）、石蜡切片机（辅光精密仪器(上海)有限公司生产，

型号FPMRC-MIT-45B）、无菌试管及玻片。

1.3 兔KOA模型建立

兔KOA模型建立，Hulth方法建立，20%乌拉坦5 mL/kg，行静脉麻醉；于兔右侧髌内侧做2 cm切口，逐层切开皮下组织，充分打开关节腔，外翻髌骨，将内侧副韧带、前后交叉韧带切断后，内侧半月板切除；关节腔冲洗干净后，逐层缝合切口，取青霉素钠40万U/d肌注，连续7 d。术后伤肢无需固定，每天驱兔奔跑2次，每次30 min。模型建立8周，拍摄膝关节X线片，确定动物模型是否建立成功。

1.4 实验方法

实验5组患者在兔KOA模型建立成功后，取1%利多卡因局部麻醉，兔右下肢行股神经置管，皮下埋管于兔背，外接镇痛泵（1 mL/h）、0.2%盐酸罗哌卡因行连续股神经阻滞（2 mg/L），实验1～5组阻滞1周、2周、4周、6周及8周。空白组无需使用药物，兔实验期间正常饲养，继续驱兔活动30 min，观察兔的一般行为学表现，对家兔疼痛评估表进行量化。

1.5 观察指标

（1）炎性因子表达：实验结束后，兔模型以气栓法处死，逐层切开膝关节，滑膜液抽取，以酶联免疫吸附法（ELISA）检测滑膜液内IL-1、IL-6及TNF-α，具体步骤按试剂盒说明书操作；（2）组织形态学：取兔关节滑膜，10%甲醛溶液固定标本48 h，脱钙处理，脱钙液更换，冲洗多余固定液，过夜；室温下以梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，以石蜡包埋，修样、切片，组织附着于处理后的载玻片，60 ℃恒温烘箱烤片12 h，染色，树胶封片，观察形态学；（3）P物质：分别采集耳缘静脉血2 mL，加入抗凝管内，离心10 min，转速3 000 r/min，ELIS法测定P物质浓度。

1.6 统计学方法

SPSS23.0统计学软件处理数据。计量数据采取t检验；计数资料采取χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 兔KOA模型验证

兔KOA模型建立8周，与对照组相比，模型组及实验组兔膝关节关节间隙缩窄，出现骨赘、腔骨平台骨硬化，说明模型建立成功。

2.2 疼痛评分

如表1所示，空白组大兔无明显不适行为改变。模型组大兔出现倦怠、食欲下降、膝关节肿胀等表现，自我孤立，活动减少，患肢自残行为加重，部分兔子呼吸困难，符合中度至重度疼痛行为。实验5组大兔体质量下降，跛行、食欲下降、脱毛、活动减少、存在拱背行为，无明显呼吸困难，与轻度至中度疼痛行为相符。疼痛评分以10分制计算，与空白组相比，模型组疼痛评分明显增加（P＜0.05）；与模型组比较，连续股神经阻滞时间越长，疼痛评分越低（P＜0.05）。

表1 不同组别KOA兔疼痛评分比较

2.3 炎症因子表达

如表2所示，模型组IL-1、IL-6及TNF-α表达均高于空白组，有统计学意义（P＜0.05）；与模型组相比，实验组IL-1、IL-6及TNF-α表达明显下降，有统计学意义（P＜0.05）；其中实验3组、4组及5组下降逐渐明显，有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 组织形态学

空白组大兔软骨细胞大小相同，表面光整、平滑，排列整齐，结构清楚。模型组软骨细胞减少，见缺损、裂隙，排列紊乱，表面局部凹凸不齐，软骨层变薄；实验组软骨发黄，色泽暗淡，见纤维样改变、变软，滑膜及周围组织充血增生，伴炎症表现。

表2 不同组别炎症因子表达（pg/mL）

2.5 P物质阳性反应浓度表达

如表3所示，与空白组比较，模型组、实验组血清P物质阳性表达存在明显差异，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验1～5组血清P物质阳性表达低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 不同组别P物质阳性反应浓度表达比较

3 讨论

研究建立兔KOA模型，行连续股神经阻滞镇痛，分析镇痛机制，发现模型组及实验组出现不同程度的疼痛反应，但连续股神经阻滞可减轻疼痛程度，显示较好的镇痛效果。实验组IL-1、IL-6及TNF-α表达明显低于模型组（P＜0.05）。因此连续股神经阻滞缓解KOA兔疼痛可能是降低滑膜液内炎症因子表达，抑制或缓解机体炎症反应[3]。

P物质与疼痛之间的关系，主要是P物质具有传递伤害性信息的作用，通过外周伤害性刺激，促使脊髓背角P物质的释放；P物质具有扩展性致敏作用，可促进伤害性感受器的活性，促进肥大细胞释放组胺等致痛物质，形成持续性疼痛反应[4]。研究提示，连续股神经阻滞能降低P物质反应浓度，起到一定的疼痛阻滞作用。