淫羊藿苷对成骨细胞活性氧自由基氧化损伤的影响

刘海微，王佳慧，虞芳梅，黄敏华，黄海冰，梁舒贝，郑佩佩，黎宝丹，张洁，廖建敏

（桂林医学院生物技术学院，广西 桂林 541100）

0 引言

氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤[1]。活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）属于体内高活性分子，包括超氧阴离子（.O2-）、羟自由基（.OH）和过氧化氢（H2O2）等[2]。机体在炎症、衰老、激素缺乏等病理条件下产生过度的活性氧自由基，对骨组织细胞产生的氧化损伤，是引起骨质疏松和骨坏死等骨病的重要因素[3-4]。因此，对抗或削弱活性氧自由基的影响，是防治这类骨病的重要手段。

淫羊藿作为一味传统的补肾壮骨中药，具有多种药理活性，在骨骼系统应用方面主要用于防治骨骼疏松症[5]。淫羊藿提取物淫羊藿苷分子式为C33H40O15，相对分子质量为676.67，是一种植物黄酮苷类化合物，有抗氧化，能增强抗氧化酶活性，减少自由基产物的作用，其可促进成骨细胞增殖和成骨分化[6]。因此，它很可能是对抗成骨细胞氧化损伤的药物。但是，国内外较少淫羊藿苷药物干预对成骨细胞活性氧自由基氧化损伤影响的研究。本实验通过分子生物学方法探究淫羊藿苷药物干预对成骨细胞活性氧自由基氧化损伤影响，以确定可对抗过氧化氢损伤作用的淫羊藿苷浓度，探明淫羊藿苷缓解氧化应激和氧化损伤的过程和机理。

1 材料与方法

以10-5mol /L 的H202处理体外培养的融合状态MC3T3-E1 成骨细胞5 min，然后分别以终浓度为0、10-6、10-7和 10-8mol/L 的淫羊藿苷干预培养上述氧化损伤细胞，在加药48、72 及96 h 后，以MTT 法检测细胞增殖活性。用不同浓度ICA 干预上述氧化损伤细胞48 小时后，加成骨诱导液培养第3 天、第6 天后用ALP 试剂盒检测上清中ALP表达水平；14 天后用茜素红进行矿化沉积染色。

2 结果

2.1 细胞增殖（MTT 法）。经10-5mol/L H2O2处理后，用不同浓度ICA 干预MC3T3-E1 细胞（实验组），与无ICA干预组细胞相比，各实验组的OD 值均呈增长趋势，证明各组的ICA 均能显著促进氧化损伤的成骨细胞增殖（三组P＜0.05，表1）。

表1 过氧化氢处理的成骨细胞在ICA 干预下的细胞增殖MTT 测定（）

表1 过氧化氢处理的成骨细胞在ICA 干预下的细胞增殖MTT 测定（）

时间 0 10-8 mol/L 10-7 mol/L 10-6 mol/L 48 h 0.339±0.047 0.413±0.012⋆ 0.487±0.022⋆⋆ 0.563±0.015⋆⋆72 h 0.344±0.033 0.430±0.014⋆⋆ 0.410±0.047⋆ 0.443±0.004⋆⋆96 h 0.451±0.030 0.604±0.022⋆⋆ 0.506±0.300⋆ 0.555±0.023⋆⋆

2.2 细胞碱性磷酸酶（ALP）活性测定。不同浓度 ICA 处理细胞诱导分化3 天后ALP 活性均增加显著（P＜0.05）；诱导6 天，仅有10-7mol/L ICA 组中ALP 活性差异显著（P＜0.05，表2）。

表2 过氧化氢处理的成骨细胞在ICA 干预下的碱性磷酸酶（ALP）活性

表2 过氧化氢处理的成骨细胞在ICA 干预下的碱性磷酸酶（ALP）活性

浓度 3 d 6 d 0 0.381±0.006 0.370±0.001 10-8 0.471±0.006⋆⋆ 0.377±0.003 10-7 0.511±0.001⋆⋆ 0.388±0.012⋆10-6 0.444±0.005⋆⋆ 0.375±0.006

2.3 骨矿化沉积染色。三组浓度ICA 干预组钙化区域均比对照组大，其中10-7mol/L 钙化区域最多（图1）

图1 过氧化氢处理的成骨细胞在不同浓度的ICA 干预48 h 后骨矿化沉积染色的影响

3 讨论

H2O2是一种代表性的活性氧，能抑制MC3T3-E1 细胞的增殖和分化，并呈浓度时间依赖性[7]。已知淫羊藿苷具有强筋健骨和清除氧自由基能力，可促进成骨细胞生长分化，常用于促进骨折愈合和治疗骨质疏松[8]。本研究的 MTT 实验表明，三组不同浓度的ICA，均能促进MC3T3-E1 成骨细胞增殖。

骨特异性碱性磷酸酶分泌的增加反映着成骨细胞活性的增强[9]。实验表明，三组不同浓度的ICA 均使受氧化损伤的成骨细胞ALP 合成增加，10-7mol/L（P＜0.05）ICA 干预成骨细胞ALP 活性最高，促细胞分化作用最明显。骨矿化结节是成骨细胞持续分化到后期的标准，染色结果表明，三种浓度ICA 干预的实验组骨矿化结节较对照组多，而 10-7mol/LICA 组骨矿化结节最多，说明三种浓度ICA 均可促进受氧化损伤的成骨细胞化成熟后期的骨矿化结节的生成，10-7mol/L 促进作用最为明显。总的来说，10-7mol/L 的ICA 削弱氧化损伤并促进细胞分化的作用最佳[10]。