改良Gordon-sweet 网状纤维染色液的配制方法及应用体会

薛逢贵，胡爱华

（1.海南医学院第一附属医院 病理科，海南 海口 571199；2.海南医学院基础医学与生命科学学院 形态实验室，海南 海口 571199）

0 引言

网状纤维由网状细胞所产生[1]，属于结缔组织的一种纤维，网状纤维穿行于网状细胞体和胞突之间共同构成完整网状支架，主要由是Ⅲ型胶原蛋白构成，纤维上包有一层特殊的糖蛋白，它具有嗜银性，所以网状纤维又称为嗜银纤维，从而也利用网状纤维的此特点，用银氨液浸染后再用甲醛还原使网状纤维变成黑色，从而显示网状纤维为黑色。

在日常的病理诊断中，网状纤维染色是病理诊断工作中最常用的特殊染色方法之一，显示病变组织网状支架的破坏情况[2]，观察其粗细、是否断裂及塌陷等从而来判断病变的破坏程度以及发展转归等有着指导作用。网状纤维常用的Gordon-sweet 染色法步骤多，容易受很多因素的影响。我们采用了购买的试剂盒染色法与改良的Gordon-sweet 染色法对比，改良的Gordon-sweet 染色获得了较好的效果。

1 材料与方法

1.1 材料。组织取自海南医学院第一附属医院病理科，本院临床送检的慢性乙型肝炎的肝穿刺组织标本。

1.2 方法。试剂盒染色法与改良的Gordon-sweet染色法对比。

1.2.1 试剂盒染色法：切片5 um，在65°烤箱3h，或在80°烤箱20 min；（以切片石蜡烤融为准）脱蜡至水，蒸馏水洗3 遍进行染色：①高锰酸钾滴染5 min，流水冲洗；②草酸1 min，流水冲洗；③银氨液滴染5 min，去离子水洗5-10s；④硫酸铁铵5 min，去离子水冲洗10 s；⑤甲醛溶液还原30 s，流水冲洗；⑥氯化金滴染5 min；⑦流水冲洗30S；⑧5%硫代硫酸钠滴染2 min 流水冲洗；⑨脱水透明封片。

1.2.2 改良的Gordon-sweet 染色法

（1）所需试剂。0.5%高锰酸钾水溶液，0.5%硫酸水溶液、1%草酸溶液、2.5%硫酸铁铵溶液、1%氯化金溶液、5%硫代硫酸钠溶液、10%硝酸银溶液、3%氢氧化钠溶液、1%醇溶伊红。

（2）试剂准备。①酸化高锰酸钾：0.5%高锰酸钾水溶液，0.5%硫酸水溶液临用时等份混合。②银氨溶液：取10%硝酸银溶液5 mL 置于50 mL 量筒内，逐滴滴加浓氨水，边滴加边震荡混匀，直至产生的沉淀恰好溶解但未溶尽（15-20滴即可溶解，先加10 滴，混匀后，每加一滴都需充分混匀），再加入3%氢氧化钠水溶液5 mL，此时溶液产生沉淀，为使沉淀溶解，再逐滴加入浓氨水，每滴加一滴同时震荡搅拌，直至沉淀几乎全部溶解（5-10 滴即可溶解，先加3 滴，混匀后，每加一滴都需充分混匀），最后加蒸馏水水至50 mL，储存于密闭避光的容器，存放入4°冰箱中（两周左右使用完），使用时取约20 mL 置于五片装玻片盒中。

（3）染色。切片5 um，免疫组化挂胶白片捞片，65°烤箱3h，或80°烤箱20 min；（以切片石蜡烤融为准）蒸馏水洗3 遍进行染色：①酸化高锰酸钾5 min，流水冲洗30 s，蒸馏水洗3 遍；②1%草酸1-2 min，流水冲洗30 s，蒸馏水洗3 遍；④2.5%硫酸铁铵5 min；蒸馏水快速冲洗2 次；⑤银氨液浸染2 min，蒸馏水快速冲洗2 次；⑥20%甲醛溶液浸染3 min；流水冲洗1 min，蒸馏水洗3 遍；⑦1%氯化金滴染5 min，流水冲洗30 s，蒸馏水洗3 遍；⑧5%硫代硫酸钠滴染0-2 min，流水冲洗30 s，蒸馏水洗3 遍；⑨1%醇溶伊红5 s；⑩脱水透明封片。

2 结果

2.1 试剂盒组：网状纤维呈现黑色、细丝状，胶原纤维呈棕色，细胞核黑色，且组织中有银离子沉淀，如图1。

图1

图2

2.2 改良的Gordon-sweet 染色法网状纤维呈现黑色、细丝状，胶原纤维呈棕红色，背景为红色，对比鲜明，且组织中银离子沉淀少，如图2。

3 讨论

网状纤维染色中使用的氨银溶液其主要成分为氧化二氨络银液，对网状组织有很强的亲和力，络合物与组织易吸附在一起，再经还原剂还原成黑色的金属银后镀在网状纤维其表面[3]，得以显色。因此配制Gordon-sweet 氨银溶液非常关键，所使用的玻璃器皿要洗洁精洗干净后用流水冲洗再放入烤箱烤干，临用前还需用蒸馏水洗净等等[4]，以避免杂质与银发生反应，而影响实验效果；用的10%硝酸银水溶液及氨水须新鲜，并且应逐滴加入浓氨水，一边滴加一边震荡摇匀，严格控制所滴加的浓氨水剂量；配制好的银氨溶液对空气、光很敏感，一般现配现用，或密封避光保存于4°冰箱中，两周内使用完。

3.1 染色产生脱片及对比度差主要有以下因素。①银氨液属于碱性液，经碱性液处理的组织切片较容易掉片。②未酸化高锰酸钾处理后的组织切片再银氨染色后，细胞核呈黑色，在细胞密集的组织中不易分辨出网状纤维，背景对比差；③采用试剂盒方法时，由于试剂量少，使用滴染的方法，此时银氨溶液暴露于空气中，与空气反应，组织中易产生较多银离子沉淀，造成背景高。

3.2 采取的措施包括。①改用免疫组织化学专用挂胶片，防止脱片；②酸性高锰酸钾溶液较高锰酸钾溶液的氧化性强，经酸化高锰酸钾溶液处理后再进行银氨染色，其细胞核不显示，但需要注意的是其氧化性强，氧化时间须注意，时间过长容易脱片；③银氨溶一般现配现用，滴染改为在容器内密封避光浸染，浸染后迅速用蒸馏水洗，减少银离子在组织中的沉淀；④使用伊红复染，背景为红色，网状纤维为黑色，胶原纤维为棕红色，对比明显（如需显示细胞核核，可使用核固红复染5 min）；⑥经过我们的实践证明，改良的Gordon-sweet 染色法提高网状纤维染色质量，自行配制的银氨溶液价格远低于购买的试剂盒价格，减少经济成本[5-6]。