伊豆锦葡萄皮花青素的树脂纯化及稳定性研究

生庆海，闫 斌，王 晔，2，刘 坤，贾艳菊

（1.河北经贸大学生物科学与工程学院，河北石家庄 050061；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）

花青素是一类常见的天然色素，主要存在于植物的果实、叶片和花中，使植物呈现不同颜色[1]。由于花青素不稳定，天然条件下花青素通常与糖形成花色苷。花色苷是黄酮类物质，是可以安全食用的植物色素[2]。可以作为食品添加剂、着色剂应用于食品，相对于合成色素，天然色素满足了人们对于食品安全的要求，近年来越来越受到人们的欢迎。

天然花色素的纯化一般以植物为原料，常见的有杨梅、越橘、火龙果、葡萄、红心萝卜等[3]，但由于其含量较低且价格较高等原因，在我国只有较少的开发利用，不能满足市场的需求[4]。大孔树脂吸附法是目前纯化花色苷类物质最常用的方法，效果较好的大孔树脂有XAD-7HP，X-5，AB-8，NKA-9型等[5]。伊豆锦葡萄是景川彦雄于1970年杂交得到的葡萄品种，属于巨峰群品种，粒大饱满，呈紫黑色，微有草莓香味，皮厚肉脆[6]。伊豆锦葡萄皮含有大量的花青素，目前还没有关于其花青素提取及稳定性的研究。试验以伊豆锦葡萄皮为原料，研究其葡萄皮中花青素的纯化及稳定性，为伊豆锦葡萄资源的开发利用和天然花青素的获取、应用提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验材料：伊豆锦葡萄，2016年9月购自紫藤葡萄庄园。剔除果肉的果皮，风干打成粉，过40目筛，干燥器中保藏，备用。

主要试剂：柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸乙酯、没食子酸、福林酚等，均为国产分析纯；ADS-8，AB-8，HPD-100A，SP207型大孔树脂，天津尖峰天然产物研究公司提供。

主要仪器：R201型旋转蒸发器，上海申胜生物技术有限公司产品；UV-5200B型紫外分光光度计，上海光谱仪器有限公司产品；PHS-3C型数字显示酸度计，上海仪电科学仪器股份有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 伊豆锦葡萄皮色素色价的测定

参照邓洁红等人[7]的方法，稍作改变。配制酸性乙醇溶液（乙醇体积分数60%，pH值2.31），取4支离心管，每支离心管中加入0.5 g葡萄皮粉和20 mL提取液，浸提3 h后离心20 min，取上清液。一直提取至上清液无色，将所有上清液汇总过滤，最后一次的上清液和渣粉一起过滤定容，用浓度为0.1 mol/L的柠檬酸和浓度为0.1 mol/L的柠檬酸钠按一定的比例配成pH值为3的缓冲溶液，用分光光度计于波长500～700 nm内扫描，找到最大吸收峰。计算出色价。

式中：A——吸光度；

W——葡萄皮质量，g。

结果表明，尹豆锦花青素溶液于波长543 nm处有最大吸收峰，故选择543 nm作为测定波长，伊豆锦葡萄皮中色素的色价为6.7。

1.2.2 伊豆锦葡萄皮花青素的提取

称取50 g葡萄皮渣，加入酸性乙醇溶液（pH值2.31，60%乙醇），比例为1∶30，超声波辅助提取60 min，于40℃下抽滤，将粗提液在45℃下以转速100 r/min旋转蒸发，加入2倍体积的乙酸乙酯进行萃取，分层后取水相，萃取2次，于4℃下保存。

1.2.3 树脂的选择

准确称量已经活化好的 ADS-8，AB-8，HPD-100A，SP207型4种大孔吸附树脂各0.5 g，配制pH值2.47（含乙醇6.6%）的花青素溶液（C0），取15 mL，置于100 mL三角瓶中，于20℃下以转速100 r/min培养20 h。测溶液中花青素浓度（C1），计算吸附率。吸附完成后，蒸馏水洗脱，再分别加入15 mL酸性乙醇溶液（pH值2.47，80%乙醇，0.3%柠檬酸），25℃下解析20 h，测定解析液中花青素的质量浓度（C2），计算解析率。每组设置3组平行试验。

式中：C0——吸附前溶液中花青素质量浓度，mg/mL；

C1——吸附后溶液中花青素质量浓度，mg/mL；

C2——解析后溶液中花青素质量浓度，mg/mL。

1.2.4 伊豆锦葡萄皮花青素浓缩液的制备

选择最佳树脂进行活化，装柱，在上柱液pH值2.0，流速1 mL/min的条件下进行纯化，用酸性乙醇溶液（pH值2.47，80%乙醇，0.3%柠檬酸）进行解析，得到浓缩溶液。

1.2.5 伊豆锦葡萄皮花青素稳定性分析

（1） 光照对稳定性的影响。取一定量浓缩溶液，稀释到一定色价，分别取10 mL置于透明玻璃样品瓶中，封口，分别置于黑暗、自然光、日光灯下的环境中，每2 d取样测定样品溶液中花青素含量，以保存率表示原花青素稳定性，计算公式为：

式中：W1——检测时样品中花青素含量，%；

W2——初始样品中原花青素含量，%。

（2）温度对稳定性的影响。取一定量浓缩溶液，稀释到一定色价，分别取10 mL置于透明玻璃样品瓶中，封口，分别位于4℃，室温，40，60，80℃下进行保存，每隔1 h测1次吸光度，其他步骤同1.2.5（1）。

（3）pH值对稳定性的影响。取一定量的花青素浓缩液，稀释成pH值为2.2，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0的溶液，观察颜色变化，测定吸光度。

（4）金属离子对稳定性的影响。取一定量浓缩溶液，稀释到一定色价，分别取10 mL置于透明玻璃样品瓶中，分别加入 K+，Na+，Ca2+，Fe2+，Fe3+，Al3+，使溶液中各类离子的浓度分别达到1 mmol/L和10mmol/L，每1h测1次吸光度，其他步骤同1.2.5（1）。

（5）氧化剂对稳定性的影响。配制质量分数为0.05%，1.00%，2.00%，3.00%的H2O2溶液，依次取5 mL的花青素溶液，分别用不同浓度的H2O2溶液定容，分别在0，1，2，3，4，5 h后测定其于波长543 nm处的吸光度，其他步骤同1.2.5（1）。

（6）还原剂对稳定性的影响。配制质量浓度分别为0.04，0.08，0.16，0.32 g/L的维C溶液，依次吸取5 mL伊豆锦葡萄皮色素液，分别用不同浓度的维C溶液定容，分别在0，1，2，3，4，5 h后测定其于波长543 nm处的吸光度，其他步骤同1.2.5（1）。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂的选择结果

树脂的静态吸附（A） 和解析（B） 见图1。

由图1可以看出，型号不同的大孔树脂对伊豆锦葡萄皮花青素的吸附、解析效果存在一定差异。其中，ADS-8，AB-8，HPD-100A和SP207型树脂对花青素的吸附率分别为86.70%，90.16%，87.34%，91.35%，AB-8和SP207型树脂好于ADS-8和HPD-100A型树脂 ， 且显 著 性 差 异 （p＜0.05）； ADS-8， AB-8，HPD-100A和SP207型的解析率分别为65.42%，62.48%，67.37%，79.47%，SP207型的解析率最高且与其他3种树脂差异显著（p＜0.05）。结合两图比较可知SP207型树脂吸附和解析效果最好，SP207型树脂是最合适的树脂。

图1 树脂的静态吸附（A） 和解析（B）

2.2 伊豆锦葡萄皮花青素稳定性研究

2.2.1 光照对花青素稳定性的影响

光照对稳定性的影响见图2。

图2 光照对稳定性的影响

由图2可以看出，在前6 d保存率下降的比较明显，后4 d较为平缓，保存时间越长，稳定性越低。2 d后，普通光照、日光的花青素保存率分别为90%，87%，83%，且差异显著（p＜0.05）。说明色素对于光照敏感、耐光性不好。光照会使花青素生成一种中间代谢产物，C4羟基会进一步转变成2，4，6-三羟基苯甲酸等产物，促使花青素降解，因此在花青素溶液保存时要注意避光保存[8]。

2.2.2 温度对花青素稳定性的影响

温度对花青素保存率的影响见图3。

图3 温度对花青素保存率的影响

由图3可以看出，反应5 h后，在4℃，室温，40，60，80℃的保存率分别为83.4%，74.4%，74.1%，65.0%，52.5%。根据数据可知，温度对花青素影响很大，花青素的保存率会随着温度的升高而降低，这是因为当温度升高时，花青素溶液的平衡会朝着生成无色查尔酮的方向进行，从而导致花青素的降解和褪色[9]，因此花青素保存时应该避免高温。

2.2.3 pH值对花青素稳定性的影响

pH值对花青素保存率的影响见图4。

图4 pH值对花青素保存率的影响

由图4可以看出，pH值不同，花青素的保存率也不同。在pH值2～3内，吸光度值较大。在不同酸碱条件下，溶液颜色也会显现出明显差别，当溶液是碱性的时候呈现蓝色，在中性的时候呈现紫色，在酸性溶液中呈现红色。据文献记录，当pH值小于2时，花青素主要是以红色的2-苯基苯并吡喃阳离子存在，当pH值小于8时，主要是以无色的甲醇假碱或查尔酮存在，当pH值大于8时主要是以蓝色的离子化醌式碱的形式存在[10]。

2.2.4 金属离子对花青素稳定性的影响

金属离子对花青素保存率的影响见图5。

由图5可以看出，10 mmol/L的钾离子对花青素的稳定性影响不大，5 h后保存率依然为86%；1 mmol/L的钾离子、钙离子和钠离子对花青素的稳定性均有一定影响，反应5 h后保存率依然在60%以上。三价铁离子和二价铁离子对花青素的稳定性有明显的破坏作用，随着时间的延长，花青素的保存率明显下降，且浓度高的保存率更低。铝离子则有明显的增色效应，1 mmol/L和10 mmol/L的铝离子均增强了花青素溶液的保存率，而且10 mmol/L的保存率略高于1 mmol/L。

图5 金属离子对花青素保存率的影响

2.2.5 氧化剂对花青素稳定性的影响

H2O2对花青素保存率的影响见图6。

图6 H2O2对花青素保存率的影响

由图6可以看出，H2O2对葡萄皮花青素的稳定性有很大的影响，加入过氧化氢的花青素溶液的保存率均低于对照组，反应2 h后H2O2质量分数为0.5%，1.0%，2.0%，3.0%时，花青素溶液的保存率分别为86%，85%，83%，83%，随着质量分数的增大，保存率在下降。反应5 h后保存率分别为71%，70%，69%，61%。由此可见，H2O2会使花青素的保存率快速下降。可能是由于H2O2可直接亲核进攻花青素的C位，使花青素开环生成查尔酮，查尔酮进一步降解生成各种无色的酯类物质[8]。

2.2.6 还原剂对花青素稳定性的影响

维C对花青素保存率的影响见图7。

图7 维C对花青素保存率的影响

由图7可以看出，维C加速花青素的降解，使花青素保存率降低，对花青素稳定性有一定的影响。1 h后维C质量浓度为0.04，0.08，0.16，0.32 g/L时花青素溶液的保存率分别为87%，86%，88%，87%；5 h后维C质量浓度为0.04，0.08，0.16，0.32 g/L时，花青素溶液的保存率分别为67%，64%，63%，52%，随着质量浓度的增大，花青素溶液的保存率下降，且加入抗坏血酸后花青素的保存率均低于对照组，可见抗坏血酸对花青素有一定的影响。

3 结论

伊豆锦葡萄皮花青素溶液最大吸收峰为波长543 nm处，伊豆锦葡萄皮中色素的色价为6.7。大孔树脂SP207对伊豆锦葡萄皮中的花青素具有良好的吸附和解析性能，纯化效果非常理想。伊豆锦葡萄皮花青素溶液在不同pH值下颜色有所不同，pH值在2.2～3.0时花青素水溶液为红色，pH值4.0时为淡黄白色，pH值5.0时为黄色，pH值6.0时为红紫色，pH值7.0～8.0时为暗兰紫色。高温、光照、氧化剂和还原剂都会破坏花青素的稳定性。Fe3+，Fe2+使其保存率明显降低，10 mmol/L的钾离子对花青素的稳定性影响不大，1 mmol/L的钾离子、钙离子和钠离子对花青素的稳定性均有一定影响，Al3+对花青素稳定性有增强作用。避光、低温、低pH值，加入Al3+均有利于提高花青素的稳定性。