体外模拟消化芝麻蛋白产生多肽的抗氧化性分析

芦 鑫，胡东彬，贾 聪，高锦鸿，孙 强，黄纪念

(1.河南省农业科学院 农副产品加工研究中心，郑州 450002； 2.河南省农产品生物活性物质工程技术研究中心，郑州 450002；3.河南农业大学 食品科学技术学院，郑州 450002)

芝麻营养价值较高，是兼具药食两用的食物。传统医学认为芝麻具有延年益寿功能，能补五内、益气力、长肌肉、填脑髓、润养五脏、补肺气、止心惊，久服轻身不老[1]。现代医学已证实芝麻具有抗氧化、延缓衰老、保护肝脏、降血压等有益生理功能[2-7]。研究普遍认为芝麻的抗氧化功能主要与其含有VE、木脂素、多不饱和脂肪酸有关。芝麻中其他组分是否对其抗氧化功能有所贡献尚未有相关报道。

芝麻蛋白是芝麻重要组分之一，约占芝麻总质量的20%[8]。研究表明，芝麻蛋白经过酶解可以产生抗氧化肽[9-10]。然而，前人酶解芝麻蛋白制备抗氧化肽使用的蛋白酶以碱性蛋白酶为主，这与人体消化系统中的蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶)在酶解位点上有明显差异，所形成的多肽也会显著不同。因此，芝麻蛋白在人体经过消化是否产生具有抗氧化活性的肽段存在盲区。芝麻是我国居民的常用食物之一，明确其营养功能特性，对于保障消费人群身体健康具有积极作用。

本研究采用体外模拟消化芝麻蛋白，分析在此过程中，蛋白水解度、多肽产率与抗氧化能力变化情况，进而归纳芝麻蛋白体内消化产生抗氧化肽的特征，为芝麻蛋白体内消化与营养功能研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

芝麻，购于驻马店平舆康博汇鑫油脂有限公司，其蛋白质含量(19.5±0.76)%，脂肪含量(49.02±1.08)%，总糖含量(22.98±0.51)%，水分含量(3.69±0.07)%，灰分含量(4.81±0.06)%。

胰蛋白酶(酶活250 U/mg)、胰凝乳蛋白酶(酶活250 U/mg)、胃蛋白酶(酶活≥250 U/mg)，北京索莱宝科技有限公司；双色预染蛋白Marker(相对分子质量15～150 kDa)，上海雅酶生物科技有限公司；考马斯亮蓝G-250、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2′-联氮双( 3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐(ABTS)、2, 4, 6-三硝基苯磺酸(TBNS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)，美国Sigma-Aldrich公司；丙烯酰胺、N, N-亚甲基双丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸，美国Amersco公司；氢氧化钠、盐酸，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DYCZ-24DN型电泳仪，北京六一生物科技有限公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国伯乐生命医学产品有限公司；DNM-9606酶标分析仪，北京普朗技术有限公司；UV-6300双光束型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；XS205电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芝麻蛋白的提取

取1 000 g芝麻，按照固液比1∶6加入1 mol/L NaOH溶液，剧烈搅拌10 min，搓芝麻，用蒸馏水漂洗除去芝麻皮， 60℃干燥得到去皮芝麻。将去皮芝麻粉碎至80目，采用索氏抽提脱脂得到芝麻粕。以芝麻粕为原料，采用袁东振等[11]的方法提取得到芝麻蛋白。经测定，芝麻蛋白的蛋白质含量为(92.26± 0.21)%。

1.2.2 模拟体内消化芝麻蛋白

参照文献[12-14]的方法，并稍作修改。取80 g芝麻蛋白，加水920 mL制成蛋白质质量浓度约为8 g/100 mL的芝麻蛋白溶液，90℃加热30 min，随后降温至37.7℃，采用3 mol/L HCl调节pH至1.5，加入2.944 g胃蛋白酶水解4 h，随后加入3 mol/L NaOH调节pH到8.3，加入2.944 g胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合物(胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶酶活比为10∶3)水解6 h。水解期间，每隔30 min取样，沸水浴10 min终止反应后，冷却至室温，用3 mol/L HCl 中和，再以8 000 r/min离心30 min，取上清液(酶解液)备用。

1.2.3 酶解液水解度测定

参照Adler-Nissen[15]的方法并略作修改。取酶解液，适当稀释后取0.125 mL于试管中，加入1 mL pH 8.2磷酸缓冲液和1 mL质量浓度0.1 g/100 mL 的TNBS，铝箔遮光，在水浴锅中50℃振荡60 min后，加入2 mL 0.1 mol/L HCl终止反应，室温静置30 min，测定340 nm处的吸光度。相同条件下，分别取0.125 mL的0～2 mmol/L的L-亮氨酸与TNBS反应，制作标准曲线。按下式计算蛋白水解度。

(1)

式中：h为1 g酶解物被酶解所含的肽键量，mmol/g；htot为每克原料蛋白质总的肽键量，mmol/g，芝麻蛋白的htot取8 mmol/g[16]。

1.2.4 多肽产率测定

取0.5 mL酶解液于Amicon Ultra-4超滤离心管(截留相对分子质量30 kDa)中，以8 000 r/min离心30 min，取透过液与0.5 mL酶解液采用考马斯亮蓝法测定多肽与蛋白质含量[17]。采用下式计算多肽产率(PY)。

(2)

式中:MP为透过液中多肽含量;MT为0.5 mL酶解液中蛋白质含量。

1.2.5 芝麻蛋白及其酶解液的组成分析

分别取1.2.2中的芝麻蛋白溶液和酶解液1 mL，加入1 mL电泳处理液，在100℃水浴加热3 min，10 000 r/min离心10 min后收集上清液，用于聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。电泳条件：浓缩胶质量分数3%，分离胶质量分数12.5%，上样量5 μL，浓缩胶时电流采用12 mA，进入分离胶电流采用30 mA。凝胶经过脱色后，采用Image Lab 5.0分析谱带[18]。

1.2.6 芝麻蛋白酶解液抗氧化能力分析

1.2.6.1 DPPH自由基及ABTS自由基清除能力测定

将酶解液中多肽稀释到质量浓度0.5 mg/mL，按参考文献[16]测定其DPPH自由基和ABTS自由基清除率。

1.2.6.2 总抗氧化能力的测定(FRAP法)

取50 μL酶解液加入到96孔酶标板中，加入150 μL FRAP工作液(由pH 3.6、0.3 mol/L醋酸盐缓冲液，10 mmol/L TPTZ，20 mmol/L FeCl3溶液以体积比10∶1∶1混合)，振荡30 s， 37℃避光反应30 min，在593 nm波长处测定吸光度。另以0～2 mmol/L FeSO4标准溶液代替样品作标准曲线。样品的总抗氧化能力以具有相同吸光度的FeSO4的浓度表示，单位为mmol/g[19]。

1.2.7 数据处理

无特殊说明，所有试验平行测定3次，采用IBM SPSS25进行单因素方差分析(Duncan算法)，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。同一曲线上带有相同小写字母的数据在0.05水平上无显著差异。

2 结果与分析

2.1 体外模拟消化芝麻蛋白水解度与多肽产率的变化(见图1)

图1 体外模拟消化芝麻蛋白的水解度(a)与多肽产率(b)

由图1(a)可知：随着消化时间的延长，芝麻蛋白的水解度逐渐上升，最终趋于稳定；当进入胰糜蛋白酶消化阶段，芝麻蛋白的水解度有显著上升。这是由于相较于胃蛋白酶(胃蛋白酶的水解位点主要集中在Phe、Tyr、Trp和Leu)，胰糜蛋白酶的水解位点更加广泛(胰蛋白酶水解位点是Arg与Lys，胰凝乳蛋白酶主要作用于Trp、Tyr、Phe、Leu、Met、His)[20]，芝麻蛋白可以被水解得更加彻底，从而导致水解度显著增加。

伴随着芝麻蛋白水解度的上升，多肽产率逐渐增加，消化3 h后，虽然芝麻蛋白水解度还持续上升，但多肽产率趋于稳定(见图1(b))。这是由于测定多肽产率时，采用截留相对分子质量30 kDa超滤离心管分离消化液中的蛋白与多肽，当多数多肽相对分子质量低于30 kDa后，随着继续消化，肽键断裂造成水解度上升，多肽平均相对分子质量继续减少，多肽更容易通过超滤膜，而透过超滤膜的多肽总质量基本无变化，因而多肽产率无明显变化。

2.2 体外模拟消化芝麻蛋白组成的变化(见图2)

注：泳道1～11分别是芝麻蛋白体外模拟消化0～10 h(间隔1 h)的样品；泳道12为标准蛋白。
图2 芝麻蛋白体外模拟消化样品的SDS-PAGE图谱

由图2可见，芝麻蛋白主要由7S和11S蛋白组成(泳道1)[21]，随着消化的进行，两种蛋白被迅速破坏，转化成低分子多肽，无明显的特征条带(泳道2～4)，最终芝麻蛋白被消化成相对分子质量小于15 kDa的多肽(泳道11)。上述结果佐证多肽产率结果的同时，也表明芝麻蛋白易于被人体消化。

2.3 体外模拟消化芝麻蛋白产生多肽的抗氧化性(见图3)

由图3(a)可见，体外模拟消化芝麻蛋白过程中，消化时间在0～1.5 h，芝麻蛋白水解产生的多肽的DPPH自由基清除率迅速上升，而在2～6 h间，多肽的DPPH自由基清除率有较大波动，随后随消化时间的延长，多肽的DPPH自由基清除率趋于稳定。上述变化的原因可能是在消化初始阶段，芝麻蛋白水解产生具有抗氧化活性的多肽，导致DPPH自由基清除率上升，随着胰蛋白酶与胰凝乳蛋白酶的加入，由于酶切位点的差异，由胃蛋白酶水解产生的多肽被水解产生新的多肽，不同多肽抗氧化活性存在差异，导致DPPH自由基清除率有较大波动，但随着消化的进行，多肽组成也趋于稳定，此时DPPH自由基清除率也趋于稳定。

由图3(b)可见，由胰糜蛋白酶消化产生的多肽其ABTS自由基清除能力显著强于由胃蛋白酶消化产生多肽的，这与芝麻多肽组成与大小有关。在胃蛋白酶水解阶段，芝麻蛋白水解程度较低，多肽相对分子质量较大，内部疏水氨基酸暴露较少；而进入胰糜蛋白酶作用阶段，芝麻蛋白水解程度高，多肽相对分子质量较小，内部疏水氨基酸暴露较多。大量研究表明，低相对分子质量的多肽由于分子结构简单，活性中心暴露，其抗氧化活性强于高相对分子质量的多肽，同时疏水氨基酸通过向自由基提供电子，可提升多肽的抗氧化活性[22]。

由图3(c)可见，芝麻蛋白经过体外模拟消化产生的多肽具有一定的还原三价铁离子的能力，其最大值出现在7 h，随后有所回落。对比DPPH自由基清除能力与ABTS自由基清除能力的结果，发现芝麻蛋白经过体外模拟消化产生的多肽的抗氧化活性，在不同的评价方法中变化规律存在差异，即高DPPH自由基清除能力的多肽，其ABTS自由基清除能力与FRAP值并非也高。产生上述差异的原因：除不同评价方法引起的差异外，芝麻多肽的自身抗氧化特性也存在差别，有些芝麻抗氧化肽DPPH自由基清除能力强于ABTS自由基清除能力，而有些芝麻抗氧化肽ABTS自由基清除能力较强，如芝麻抗氧化肽丙氨酸-甘氨酸-谷氨酸-谷酰胺-甘氨酸-苯丙氨酸-谷氨酸-酪氨酸-缬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-精氨酸(AGEQGFEYVTFR)展现较强的DPPH自由基清除能力，而丝氨酸-酪氨酸-脯氨酸-苏氨酸-谷氨酸-半胱氨酸-精氨酸-蛋氨酸-精氨酸(SYPTECRMR)表现较强的ABTS自由基清除能力[10]。

图3 体外模拟消化芝麻蛋白产生多肽的DPPH自由基清除率(a)、ABTS自由基清除率(b)和总抗氧化能力(c)

3 结 论

在体外模拟消化过程中，芝麻蛋白中的7S与11S蛋白会被迅速水解成为多肽，经胃蛋白酶水解4 h，胰糜蛋白酶水解6 h，最终多肽的相对分子质量在15 kDa以下。芝麻蛋白经过体外模拟消化产生的多肽具有抗氧化性， 在消化中段时，多肽呈现较强的DPPH自由基清除能力，进入消化末期，多肽的ABTS自由基清除能力较强。上述结果表明，不同消化时段，因多肽组成的不同，其抗氧化活性存在差异。

后续将对体外模拟消化芝麻蛋白产生的抗氧化肽进行分离纯化、鉴定结构，明确其化学结构，并合成相应多肽，验证其活性并分析构效关系，同时开展细胞与动物试验，以证实其功效，从而为芝麻抗氧化肽的应用提供理论基础与数据支撑。