复烤烟叶DNA提取条件优化

吴时玺，焦凯旋，侯宁宁，胡腾飞，黄启蒙，李 萌，马 林

（1.郑州轻工业大学食品与生物工程学院，河南郑州 450000；2.浙江中烟工业有限责任公司技术中心，浙江杭州 310004）

0 引言

烟叶经不同程度的加工处理后，基因组DNA降解严重，提取的DNA产量和质量均不理想，解决此类问题，就需要对烟叶DNA的提取方法进行适当的改进，以获得品质高且适于后续试验需要的DNA。目前，提取DNA的方法有10多种，但效果各异[1-8]。聂琼等人[9]认为，目前应用于烟草总DNA的提取方法，步骤比较繁琐且所需周期较长。巩艳红等人[10]曾指出，由于不同的植物和植物自身的不同部位都各具特点，如细胞壁较厚、含酚类、含糖类物质多，很难用同一种方法去提取不同植物的DNA。何雪娇等人[11]认为，烟草不同内在成分的差异，能够直接影响DNA的提取质量，采用常规的方法很难达到理想的效果。易庆平等人[12]认为DNA提取步骤较为复杂且耗时较长，采用不同的采样时期、贮藏方法、DNA提取纯化方法等都会对DNA提取质量造成较大的影响。针对不同的研究目的，对DNA纯度和产量的要求也不同。所以，应根据不同的植物特征采用不同的方法对其DNA进行提取。影响烟叶DNA提取的因素除了烟草本身的影响外，还有许多其他方面的影响，如不同的提取方法、不同的试验步骤等。任如意等人[13]认为，基因组DNA的浓度（DNA产量）在很大程度上取决于烟叶细胞的破碎程度，通过采取不同的试验转速及不同的样品研磨次数，进而使新鲜烟叶和复烤烟叶都能进行充分的研磨，进而提高DNA产量。王桂蛾等人[14]认为，采用不同纯化及沉淀方法能影响DNA产率和品质，不同的沉淀溶剂的使用目的是为了使DNA与其他化合物分离开，从而提高DNA的纯净度。试验中影响DNA的产量和质量的影响因素还有很多，需不断地对试验条件进行优化，选取最优的条件提取烟草DNA，达到提高DNA的产量和质量。Gadani F等人[15]建立的改良CTAB法提取烤后烟叶基因组DNA。但检测结果波动较大，特别是对于保存时间较长的烤后烟叶，上述方法很难提取到主条带单一的基因组DNA。

对CTAB法进一步进行改良，通过对提取条件中的样品研磨方式、裂解时间、离心转速、洗涤剂选择4个主要影响因素进行单因素优化，并通过PCR技术检测基因组DNA的可用性，力求找到提高DNA质量和含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料

常用复烤烟草品种红花大金元、云烟85、云烟87、K326等，云南中烟工业公司提供；新鲜烟叶种子，各大中烟提供。

1.1.2 试剂

EDTA、EDTA2Na、NaCl、CTAB、PVP、β - 巯基乙醇、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、溴化乙锭、琼脂糖等试剂，均为分析纯，天津大茂化学试剂厂提供；RNA消化酶（RNase），南京诺唯赞生物科技有限公司提供。

1.1.3 仪器

JXSF TPRP-24型组织研磨仪，上海净信实业发展有限公司产品；Thermo Scientific Heraeus MicroCL 17型微量离心机、NanoDrop ND-2000C型超微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司产品；Vetiti型梯度PCR仪，美国ABI公司产品；DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂产品；Mini Bis Pro型凝胶成像分析系统，以色列DNR凝胶成像系统有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 新鲜烟叶DNA提取

取0.1 g新鲜烟叶置于1.5 mL离心管中，使用组织研磨仪磨成粉末，再用CTAB法提取烟草基因组DNA，提取的DNA于-20°下保存备用。

1.2.2 复烤烟叶DNA提取

取0.1 g复烤烟叶置于1.5 mL离心管中，使用组织研磨仪磨成粉末，再用CTAB法提取烟草基因组DNA，提取的DNA于-20°下保存备用。

1.2.3 复烤烟叶DNA提取优化

对复烤烟叶（以红花大金元为主）DNA提取过程中的样品研磨方式、水浴时间、离心转速、洗涤剂选择这4个主要影响因素进行单因素条件优化，找出最优提取条件，缩小与新鲜烟叶DNA的差异，满足后续试验要求。

1.2.4 烟草基因组DNA质量检测

所提取的新鲜烟叶基因组DNA和复烤烟叶基因组DNA的质量浓度分别进行1.5%的琼脂糖凝胶检测和超微量分光光度检测。根据OD260/OD280的比值即可判断所提DNA的纯度。OD260/OD280的比值为1.8～2.0说明所提的DNA无降解现象，代表着蛋白质及多糖等物质去除较为彻底；若OD260/OD280＞2.0，则说明有RNA的污染；若OD260/OD280＜1.8，则说明有蛋白质的污染。

1.2.5 PCR检测

PCR反应体系：20 μL体系，50 ng/μL模板DNA 1 μL，2×Taq plus Master mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ddH2O补充至20 μL。PCR反应程序：预变性94℃，6 min；变性94℃，50 s；退火38℃，30 s，延伸72℃，90 s，40个循环；终延伸：72℃，6 min，4℃保温。取3 μL扩增产物上样于1.5%的琼脂糖凝胶中，80 V恒压电泳40 min后，紫外凝胶成像仪拍照。

2 结果与分析

2.1 改良CTAB法提取新鲜烟叶和复烤烟叶基因组DNA结果比较

新鲜烟叶基因组DNA凝胶电泳图见图1，4种新鲜烟叶基因组DNA质量浓度和纯度检测结果见表1。

表1 4种新鲜烟叶基因组DNA质量浓度和纯度检测结果

由图1可知，利用CTAB法提取的新鲜烟叶基因组DNA主条带很清楚，无明显杂带，点样孔周围基本没有发亮物质。由表1可知，提取的4种新鲜烟叶基因组DNA OD260/OD280的比值为1.8～2.0，DNA纯度较高，质量浓度也较大，符合后续试验要求。

复烤烟叶基因组DNA凝胶电泳图见图2。

由图2可知，所提取的复烤烟叶DNA主条带不清晰，点样孔周围发亮，条带弥散切拖尾严重。说明其内含有大量RNA、蛋白质、多糖、多酚、盐类等杂质。目前的CTAB法对复烤烟叶DNA提取不合适，需要进一步优化DNA提取条件，去除这些杂质对DNA纯度和含量的影响。

2.2 复烤烟叶基因组DNA提取方法优化

2.2.1 复烤烟叶研磨次数优化

复烤烟叶研磨次数优化的琼脂糖凝胶电泳分析见图3。

由图3可知，DNA主条带的完整性明显较差，均存在不同程度的杂质污染。研磨2次和研磨3次的DNA主条带相比研磨1次和研磨4次主条带清晰，效果较好。

不同研磨次数对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析见表2。

表2 不同研磨次数对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析

由表2可知，无论研磨几次，OD260/OD280的比值均满足试验要求，但OD260/OD230的比值均较低，都存在着不同程度的小分子盐类对其影响。相比之下，研磨2次的OD260/OD230最接近2.0，较符合要求。故综合图3和表2中数据得到结论：在研磨仪频率为65 Hz，120 S的条件下，研磨2次提取的烟叶DNA效果好于研磨1次，3次，4次。

2.2.2 复烤烟叶转速优化

复烤烟叶转速优化的琼脂糖凝胶电泳分析见图4。

由图4可知，样品1、2含有严重的拖尾现象，看不到DNA主条带。样品3有明显的DNA主条带，但也有轻微拖尾现象。

不同转速对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析见表3。

表3 不同转速对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析

由表3可知，OD260/OD280均为1.8～2.0，说明其内酚类和蛋白质去除较为完全，但是OD260/OD230的比值均低于2.0，这说明其内有残存的小分子或者盐类的影响。随着转速的提高，OD260/OD230依次增高，由于该比值在2.0左右才满足试验要求，从表3可知转速为9 000 r/min时试验结果最符合要求。故认为转速为9 000 r/min时效果最佳。

2.2.3 复烤烟叶水浴时间优化

复烤烟叶水浴时间优化的琼脂糖凝胶电泳分析见图5。

由图5可知，提取的烟叶基因组均能得到清晰的DNA主条带，但水浴25，35 min的DNA主条带亮度较弱，完整性较差，有拖尾现象；水浴30，40 min所提DNA主条带清晰，点样孔附近有很少量蛋白质残留，效果较好。

水浴时间对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析见表4。

表4 水浴时间对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析

由表4可知，无论水浴25，30，35，40 min，OD260/OD280的比值都能满足试验的要求均在1.95左右，而OD260/OD230唯有在65℃下水浴30 min才能在2.0左右（根据查阅文献，该比值在2.0左右DNA的纯净度较高）。故综合图5及表4中数据得到结论，采用水浴时间为30 min提取的烟叶DNA的效果好于水浴 25，35，40 min。

2.2.4 复烤烟叶洗涤剂优化

复烤烟叶洗涤剂优化的琼脂糖凝胶电泳分析见图6。

由图6可知，1号样品无明显DNA主条带，且拖尾严重。2，3，4中可以看到明显的DNA主条带，但只有3号样品有轻微的拖尾现象，点样孔附近残留的蛋白质最少，故样品3的效果最佳，即采用70%乙醇进行DNA除杂效果最为明显。

采用不同的洗涤剂对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析见表5。

表5 采用不同的洗涤剂对复烤烟叶DNA质量浓度的影响分析

由表5可知，采用无水异丙醇及无水乙醇处理样品的OD260/OD230偏低，有较多的小分子或者盐类杂质的存在。相比较，由OD260/OD230的比值可看出采用70%异丙醇和70%乙醇处理的盐类杂质较少，但从DNA电泳结果可看出，70%异丙醇处理的DNA主条带不清晰且拖尾严重，不能满足试验的需求。故综合表5及图6得出结论，采用70%的乙醇处理所获得的DNA的纯净度最好且质量浓度较高。

2.3 PCR检测

为了考查进一步优化后的CTAB法对复烤烟叶基因组DNA的可用性，用引物28、W11进行PCR扩增。

PCR检测的琼脂糖凝胶电泳分析结果（引物S28） 见图7，PCR检测的琼脂糖凝胶电泳分析结果（引物w11） 见图8。

由图7～图8可知，4种不同的烟叶品种经过PCR扩增后，均能从琼脂糖凝胶电泳中看出有明显的扩增条带，说明提取的DNA能够很好地满足后续PCR对模板DNA的要求，即用进一步改良后的CTAB法提取烟草DNA的方法是可行的。

3 结论

通过对CTAB法提取植物基因组DNA过程中的研磨方式、裂解时间、离心转速、洗涤剂选择，这4个主要影响因素进行单因素优化。结果表明，采用65 Hz于120 s条件下研磨2次；以转速9 000 r/min对样品进行离心；水浴时间30 min及70%乙醇作为洗涤剂。在该优化条件下所提烟叶的DNA质量浓度和含量较之前有较大提升，可满足后续PCR试验要求。

除此之外，试验中发现适当的加大PVP、β-巯基乙醇的用量，其DNA提取效果更佳，主带条清晰、无拖尾现象，纯度较高且OD260/OD280的比值为1.8～2.0，OD260/OD230为2.0左右，能够满足后续PCR试验对DNA模板的要求。通过多次重复试验验证，进一步优化后的CTAB法提取的烟叶DNA结果稳定。但不同品种间提取的DNA效果可能存在些许差异，需要适当地增减β-巯基乙醇的用量才可达到更好的提取条件。

与新鲜烟叶相比，提取的复烤烟叶基因组DNA效果不佳，分析原因可能是：①试验材料的差异。健康、新鲜、幼嫩的烟草叶片细胞正处于分裂期，含有较多完整的DNA，并且代谢物较少，是理想的植物DNA提取材料。烟叶经过复烤之后，存在较多的多糖、多酚等代谢产物，会使DNA的提取纯度降低，并且其DNA的完整性也遭到不同程度的破坏，这对后期的DNA提取更加困难。②烟叶研磨方式。新鲜的烟叶其组织细胞有一定的韧性，液氮研磨或者组织研磨器研磨对DNA基本没有损伤；烟叶经过复烤之后，其内的组织、细胞变得更加脆弱，外部的机械力量会加速研磨过程中DNA的降解，使得完整的DNA链断开。③水浴过程。新鲜烟叶包裹着DNA的细胞壁较为坚韧，通常水浴40～50 min才可以将细胞壁完全破裂开来，使内部的DNA完全裸露出来；复烤后的烟叶其细胞壁经过打叶复烤过程的加工后已经变得比较脆弱，此时只用水浴20～30 min即可，若水浴时间过长则会使DNA完全降解，导致最终无法提取出烟叶DNA。④离心过程。新鲜烟叶的DNA因未经外部高强度力量的破坏，DNA链可经受高转速离心；复烤后的烟叶高转速的离心力会使得完整的DNA链破碎成小片段，从而导致最终提的DNA条带模糊，含量较低。⑤洗涤剂差异。对于新鲜烟叶来说，其DNA链较为完整，洗涤剂对DNA提取没有影响，即哪种洗涤剂都可；对于复烤烟叶来说，其DNA链存在着不同程度的破坏，对于洗涤剂的要求较高，试验后发现用70%的无水乙醇对DNA进行洗涤效果好于其他洗涤剂。