全自动烷基汞分析仪测定饲料中的甲基汞和乙基汞

2020-05-16汪海滨唐雪娟李浩洋

中国饲料 2020年5期

汪海滨，唐雪娟，李浩洋

（1.中山市第一中等职业技术学校，广东中山 528400；2.中山海关技术中心，广东中山 528400）

汞在自然界中主要以无机汞和有机汞等形式存在，有机汞的毒性强于无机汞，其中甲基汞是毒性最强的有机汞，乙基汞的毒性次之。甲基汞和乙基汞均具有亲脂性、生物累积性和生物放大效应，可通过食物链迁移危害人体健康，尤其是甲基汞对中枢神经系统易造成不可逆的伤害（张兰等，2009）。因此，自日本水俣病事件发生后，有机汞造成的食源性危害引起了世界的广泛关注（Elinal等，2007）。饲料是动物养殖过程中获取营养元素的主要来源，其所含有的有机汞能在动物体内富集进而威胁人们身体健康（陈岩等，2016；丁红梅等，2013）。因此，对饲料中有机汞检测方法的研究具有重要意义。

目前，比较成熟的甲基汞和乙基汞分析方法主要为液相色谱-原子荧光光谱法（LC-AFS）（李浩洋等，2019；孙蕾等，2018）、液相色谱-电感耦合等离子体质谱法（LC-ICP-MS）（熊文明等，2013；张兰等，2009）和气相色谱-原子荧光光谱法（GC-AFS）（苏荣等，2017；崔颖等，2016）等。LC-AFS可以达到很好的分离效果，但由于流动相的稀释，其检出限相对较高，而LC-ICP-MS价格昂贵，限制了其在日常检测中的应用（顾昱晓，2013）。GC-AFS易与吹扫捕集方法联用，具有较强的分离能力和更好的灵敏度（崔颖等，2016）。全自动烷基汞分析仪将吹扫捕集模块、气相色谱模块和原子荧光光谱模块有效整合，具有灵敏度高、准确性好、操作简单等优点（唐丽嵘等，2017）。因此，本研究拟建立全自动烷基汞分析仪测定饲料中甲基汞和乙基汞的方法，以期为饲料的检验监管提供强有力的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器甲基汞标准品 [（69.5±2.6）μg/g，中国计量科学研究院]；乙基汞标准品[（70.6±2.5）μg/g，中国计量科学研究院]；ERM-CE464 金枪鱼标准物质（Joint Research Centre，European Reference Materials）；甲醇（色谱纯）、氢氧化钾、盐酸（优级纯）；实验用水为超纯水；醋酸钠缓冲溶液（pH≈5.8）：称取27.2 g三水合醋酸钠溶于80 mL超纯水中，加入1.0 mL醋酸，用超纯水定容至100 mL；衍生试剂：将 100 mL 2%（m/V）氢氧化钾溶液置于0℃冰箱中冻至出现冰晶，加入1.0 g四丙基硼化钠粉末，混匀后分装到色谱样品瓶中，冷冻备用；饲料样品为市售。

MERX-M型全自动烷基汞分析仪（美国Brooks Rand公司）；DKN612C型烘箱（日本YAMATO公司）。

1.2 仪器工作条件原子荧光检测器电压为670 V，气相色谱柱为OV-3填充柱（340 mm×1.59 mm），温度为41℃，吹扫捕集气为氮气，氮气流速为344 mL/min，吹扫捕集时间为9 min，Tenex管解析加热时间为9.9 s，捕集管干燥时间为5 min，干燥气为氮气，干燥气流速为233 mL/min，气相色谱载气为氩气，氩气流速为27.5 mL/min。

1.3 标准工作溶液配制采用称量法，用去离子水配制甲基汞和乙基汞混合标准储备液，其中甲基汞和乙基汞的浓度均为100 pg/mL。在经过高温净化的40 mL棕色进样瓶内提前加入34~38 mL去离子水，然后分别加入 0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mL混合标准储备液，再加入0.5 mL醋酸钠缓冲溶液和50μL衍生试剂，进行衍生化反应，最后加超纯水至40 mL，颠倒混匀，待测；此时，棕色进样瓶内分别含有 10、50、100、250、500 pg 甲基汞和乙基汞。

1.4 金枪鱼对照品制备在ERM-CE464金枪鱼标准物质中添加一定量的乙基汞标准品，得到金枪鱼对照品，其中甲基汞的参考值为（5.50±0.17）mg/kg，乙基汞的参考值为 2.00 mg/kg。

1.5 样品前处理准确称量0.2 g（精确到0.0001 g）饲料样品至高速离心管中，加10 mL 25%氢氧化钾/甲醇溶液，在烘箱中60℃加热5 h，然后以3000 r/min离心15 min。同时做试剂空白。提取过程中，每隔2 h用涡旋振荡仪涡旋一次，使提取液与样品充分接触。在经过高温净化的40 mL棕色进样瓶内提前加入36～38 mL超纯水，然后加入0.1 mL处理好的空白溶液或样品溶液，用10%HCl调节pH到6～8后，再加入0.5 mL醋酸钠缓冲溶液和50μL衍生试剂，进行衍生化反应，最后加超纯水至40 mL，颠倒混匀，得到空白上机溶液和样品上机溶液。

2 结果与讨论

2.1 提取方法的优化目前，有机汞的提取方式主要有酸法和碱法，其中酸法常与超声或微波辅助技术相结合（孙蕾等，2018；熊文明等，2013），碱法则可以直接加热进行提取（苏荣等，2017）。本研究分别采用盐酸微波辅助提取、盐酸超声辅助提取和碱法直接加热提取对饲料样品进行试验。结果表明，酸法前处理后的部分样品上机溶液在吹扫捕集过程中，无法通过气液分离器完全分离，少许溶液被吹扫进Tenax捕集管中，导致仪器无法运行。因此，试验选择 10%、15%、20%、25%、30%氢氧化钾/甲醇溶液60℃加热5 h，对饲料样品和金枪鱼对照品中的甲基汞和乙基汞进行检测，结果见表1。结果表明：低浓度的氢氧化钾/甲醇溶液对饲料中甲基汞和乙基汞的提取效率较低，但随着氢氧化钾浓度的增加，饲料中甲基汞和乙基汞的检测值也不断升高，当氢氧化钾/甲醇溶液浓度超过25%后，饲料样品中甲基汞和乙基汞的检测值最高且无明显变化，而金枪鱼对照品的检测值与参考值相符，这说明饲料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取过程中甲基汞和乙基汞的形态未发生转化。因此，选择25%氢氧化钾/甲醇溶液60℃加热5 h作为本研究的提取方法。

表1 提取液浓度对测定结果的影响

2.2 提取温度的优化提取温度会影响有机汞的回收率以及不同形态汞之间的转化（冷庚等，2012）。本研究在不同提取温度（40、50、60、70 ℃）下对饲料样品和金枪鱼对照品进行试验，结果见表2。结果表明：随着温度的升高，饲料样品中甲基汞和乙基汞的检测值也随之升高，当提取温度为60℃时，饲料样品中甲基汞和乙基汞的检测值达到最高，且金枪鱼对照品的检测值与参考值相符。而当提取温度为70℃，甲基汞和乙基汞的检测值反而降低，这可能是因为甲醇的沸点为64.7℃，当温度超过64.7℃后，样品和金枪鱼对照品中的甲基汞和乙基汞随着甲醇的蒸发而逸出，导致检测值偏低。由此可知，当提取温度为60℃时，饲料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取过程中甲基汞和乙基汞的形态未发生转化。

表2 提取温度对测定结果的影响

2.3 提取时间的优化本研究在不同提取时间（1、2、3、4、5、6 h）下对饲料样品进行试验。试验结果表明：随着提取时间的延长，饲料样品中甲基汞和乙基汞的检测值也随之升高。当提取时间超过5 h后，增加提取时间，甲基汞和乙基汞的测定结果均无明显变化，故从节约时间的角度考虑，选择提取时间为5 h（图1）。

2.4 色谱条件的选择影响Hg0、甲基汞、乙基汞和Hg2+衍生化产物分离程度的主要因素有两个：一是载气流速，二是气相色谱柱温度。选择载气流速为27.5 mL/min，气相色谱温度为41℃作为本研究的色谱条件，在此色谱条件下，样品溶液中Hg0（1）、甲基汞（2）、乙基汞（3）和 Hg2+（4）衍生化产物能实现完全分离，且甲基汞（2）、乙基汞（3）的峰形对称（图2）。

2.5 工作曲线和检出限将标准工作溶液和空白上机溶液上机测定，分别以甲基汞和乙基汞衍生化产物的峰高响应值对应其含量绘制标准工作曲线，其中，甲基汞的曲线方程为：Y=237.75X+120.67，线性相关系数r=0.9996，方法检出限为3 μg/kg，方法定量限为8μg/kg；乙基汞曲线方程为：Y=105.18X+152.08，线性相关系数 r=0.999 6，方法检出限为4μg/kg，方法定量限为13μg/kg，能够满足饲料中甲基汞和乙基汞的分析要求。250 pg标准工作溶液色谱图见图3。

2.6 方法精密度和回收率实验平行称取饲料样品7份，进行7次独立实验，测定结果的相对标准偏差（RSD）即为方法精密度，甲基汞和乙基汞的RSD分别为4.58%和5.19%。另平行称取饲料样品9份，分别进行高、中、低3个浓度水平的加标回收实验，甲基汞的平均回收率为91.1%～98.2%，乙基汞的平均回收率为88.5%～95.7%（表3）。

表3 方法精密度（n=7）和回收率实验（n=3）

2.7 样品分析应用建立的方法对220批市售饲料样品进行检测，包括鱼饲料50批、虾饲料20批、蟹饲料20批、饲料用红鱼粉20批、鸡饲料50批、鸭饲料20批、猪饲料30批，其结果见表4。由表4可知，鸡、鸭和猪饲料样品中均未检出甲基汞和乙基汞，而部分水产饲料样品（鱼、虾、蟹饲料及饲料用红鱼粉）中检出了甲基汞和乙基汞，但含量水平较低。