同步降解黄曲霉毒素和玉米赤霉烯酮的复合益生菌研制

王 涛， 李慧娟， 耿启泉， 常 娟， 王 平， 尹清强*，刘超齐， 朱 群

（1.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州 450046；2.河南省郑州种畜场，河南郑州 450011；3.河南省卫辉市农业农村局，河南卫辉 453100；4.河南德邻生物制品有限公司，河南新乡 453000）

黄曲霉毒素主要是由真菌属的黄曲霉菌或寄生曲霉菌产生的一类带香豆素和双呋喃环的毒性代谢产物。在饲料中，黄曲霉毒素多数来自于发霉的玉米（段保宁，2018）。在黄曲霉毒素中，AFB1被世界癌症研究中心列为人类第一类致癌物，被认定是最强并最常见的致癌物质（Marroquíncardona等，2014），其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍、亚硝胺的75倍（Choudhury等，2011）。 人类在误食了含有黄曲霉毒素的食物后，可导致黄曲霉毒素急性中毒 （朱辉，2012），同时肝脏也受到损害，甚至诱发肝癌（Gholami-Ahangaran 等，2016）。

玉米赤霉烯酮又称F-2毒素，是由禾谷镰刀菌 （Fusarium graminearum）、木贼镰孢（Fusarium equiseti）、三线镰刀菌（Fusarium tricinctum）等真菌在适宜的条件下，生成的一类非甾体结构的化合物，具有类雌激素活性（Kuiper等，1997）。ZEA污染粮食后，在加工过程中不易被消除，进入饲料、动物养殖甚至食品加工领域，引起严重的食品安全问题，甚至危害人类的健康（陈继发等，2016；王怡净等，2002）。

近些年，霉菌毒素问题已经困扰了大多数畜牧产业，造成了巨大经济损失。由于目前关于单一AFB1或ZEA的吸收、代谢和危害的研究较多，而同时对两种毒素的交互作用、叠加毒性及危害机理的研究较少，有必要做深入研究。霉菌毒素的脱毒方式分为物理法、化学法以及生物法，其中霉菌毒素生物降解法被公认为是最有效的方法。本研究选用具有降解霉菌毒素能力的枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌与产朊假丝酵母，利用响应面回归设计获得最佳的复合益生菌配伍对两种霉菌毒素进行降解，为消除霉菌毒素的危害奠定基础。

1 材料与方法

1.1 培养基 LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、NaCl 10 g/L、酵母浸粉5 g/L，用蒸馏水定容至1 L，用NaOH溶液调节使pH为7.0，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min，于4℃保存备用。YPD培养基：蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存备用。MRS培养基（g/L)：胰蛋白胨15 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、乙酸钠2 g/L、柠檬酸二铵2 g/L、硫酸镁0.2 g/L、硫酸锰0.05 g/L、吐温80 1 mL，用蒸馏水定容至1 L，在121℃、1.034×105Pa条件下高压蒸汽灭菌20 min，4℃保存备用。

1.2 菌种的活化与培养 枯草芽孢杆菌接种到LB培养基上，37℃、200 r/min培养；干酪乳杆菌接种到MRS培养基上，37℃静止状态下培养；产朊假丝酵母接种到YPD培养基上，30℃、200 r/min培养。三种菌培养24 h后分别按2%的接种量接入对应的新鲜培养基，再培养24 h后测定活菌数。

1.3 复合益生菌体外降解霉菌毒素的响应面回归设计 基于生产实际考虑，将上述的益生菌活菌数调至 1.0×105、1.0×106、1.0×107cfu/mL，运用响应面回归法进行三因素三水平试验设计，测定降解霉菌毒素效果最佳的组合。利用Design-Expert 8.0.6软件，采用Box-Behnken Design （BBD）设计、模型拟合和数据分析。试验因素及水平见表1。

表1 试验设计因素及编码水平cfu/mL

为了体现自变量和因变量的关系，采用二次多项方程进行拟合，预测二次多项方程式如下：Y=β0+β1X1+β2X2+β3X3+β11X12+β22X22+β33X32+β12X1X2+β13X1X3+β23X2X3。式中：Y 是益生菌组合对霉菌毒素的降解率；X1、X2、X3是自变量，分别对应枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、产朊假丝酵母；β0是截距；β1、β2、β3是线性系数；β11、β22、β33是平方系数；β12、β13、β23是交叉系数。

1.4 复合益生菌体外同步降解AFB1+ZEA的测定方法 对照组：1.825 mL生理盐水+3 mL MRS培养基+0.125 mL AFB1标准品（2 mg/L）+0.05 mL ZEA标准品（50 mg/L）。试验组：不同体积的三种益生菌，加入 0.125 mL AFB1标准品（2 mg/L）和0.05 mL ZEA 标准品（50 mg/L），加入 3 mL MRS培养基，再加生理盐水补足5 mL。该设计共18个试验组，每个试验组做3个重复，每个重复设定AFB150μg/L、ZEA 500μg/L。 在37℃及200 r/min恒温培养箱中振荡培养24 h，然后在4℃及10000 r/min的离心机中离心5 min，取一定量的上清液，利用拜发试剂盒测定ZEA和AFB1的含量。

1.5 数据统计与分析 试验数据经Excel初步整理后，采用Design-Expert 8.0.6软件对响应面数据进行分析。采用SPSS 17统计分析软件对各组数据进行方差分析和Duncan多重比较，差异显著性用P＜0.05表示，所有结果均以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

根据Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken试验设计，其中对照组24 h后ZEA含量为589.60μg/L，AFB1含量为57.75μg/L， 对试验组AFB1+ZEA的降解率进行回归分析，建立响应面二次回归模型，寻求最优因素水平，试验结果与回归方程方差分析见表2～4。利用Design-Expert 8.0.6对数据进行多元二次回归拟合，由于在模型上选择“Quadratic”2次方重复多次试验所得的R2结果均偏低，于是选用模型“Cubic”三次方得出回归模型方程如下：

在选择模型“Cubic”三次方的基础上，多项及三次方的系数为0，所以方程里未出现系数为0的多项。与上述分析相似，由表3和表4可知，两个响应值的模型P＜0.05，说明此模型可用，在统计学上有意义。回归模型的决定系数为R2和 R2adj均大于0.80，说明回归方程的拟合度越好。基于响应面分析，当枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌与产朊假丝酵母的活菌数分别为 1×107、1×106、1×107cfu/mL时，同时降解两种毒素的效果最好，实测AFB1降解率为38.67%，ZEA降解率为26.29%。

表2 Box-Behnken设计参数与AFB1和ZEA降解率%

表3 AFB1降解率响应面回归方程系数的方差分析

3 讨论

当两种以上的霉菌毒素同时存在时，其毒性常常有加性效应（曹冬梅等，2010）。研究表明，多种霉菌毒素联合可引起动物慢性中毒，甚至导致癌症发生及免疫抑制 （Battacone等，2003；Avantaggiato等，2003）。据报道，ZEA 与 AFB1存在一定的剂量依赖关系，在AFB1浓度低的条件下，ZEA可以降低AFB1的肾细胞毒性，但当AFB1浓度高的时候，ZEA则与其呈现出协同毒性效应（雷明彦，2013）。 Williams 等（1994）报道，生长猪食用被ZEA和DON污染的玉米后，其生长性能受到影响，日采食量和日增重均下降。范彩云等（2017）研究表明，单一AFB1以及其与ZEA联合均能影响奶山羊肠道微生物区系的结构，其中混合毒素作用比单一毒素影响更大，此外混合毒素联合作用后，山羊的肠道微生物总数显著降低。本研究得到的复合益生菌组合可同时降解AFB1和ZEA，但与单一的毒素降解效果对比，两种毒素同时降解的效率都偏低，推测在添加益生菌菌液后，两种毒素存在协同作用，从而对益生菌的降解产生抵制。

表4 ZEA降解率响应面回归方程系数的方差分析

4 结论

本试验结果表明，枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、 产朊假丝酵母活菌数分别为 1×107、1×106、1×107cfu/mL时，可显著地降解AFB1和ZEA，AFB1和ZEA的降解率分别为38.67%、26.29%。