青钱柳对2型糖尿病大鼠早期肾损伤标志物以及氧化应激的影响

王蕾蕾 高学敏 贾岚 华姞安 孟靓 姚骏凯 付璐 王景霞

糖尿病并发肾脏功能损害是糖尿病患者致死、致残的重要原因，预防糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发生发展极为重要[1-2]。控制血糖和抗高血压是临床上有效的治疗策略，但疗效并不理想[3]，如在DN患者中使用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂能显著延缓DN进程[4]，但存在不良反应和用药局限性，因此需探索更加安全、有效的药物[5]。而氧化应激是DN发展中最关键的因素，持续性高血糖导致的糖代谢紊乱使机体产生大量活性氧物质[6]，损伤肾脏系膜细胞，导致肾脏纤维化。中药在DN患者临床症状改善率，降低肌酐值、尿蛋白，改善肾功能等方面均具有较大的优势，日益受到重视[7-8]。

青钱柳是双子叶植物纲胡桃科青钱柳属植物，是中国特有珍稀树种资源，与制作阿司匹林的柳树、防治癌症和肿瘤的紫杉醇并称“医学界三棵树”[9]。民间常用其叶片做茶，其性味甘寒，有生津止渴的功效，具有良好的降糖效果[10]。课题组前期研究表明青钱柳能够有效缓解肝脏氧化应激状态[11-12]。为探究青钱柳是否能降低血糖，缓解氧化应激，对糖尿病早期肾损伤起到保护作用，本研究应用高脂饲养结合腹腔注射链尿佐菌素复制2型糖尿病大鼠早期肾损伤模型，通过观察青钱柳叶对2型糖尿病大鼠肾功主要指标和早期肾损伤标志物的影响，探讨其对糖尿病早期肾损伤的保护作用，并从抗氧化应激的角度初步探讨青钱柳抗2型糖尿病大鼠早期肾损伤的作用机制，为青钱柳防治DN的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SD大鼠，雄性，SPF级，8周龄，体重180～200 g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0002，饲养于北京中医药大学屏障环境动物实验室。普通饲料和高脂饲料(猪油10%、蔗糖15%、蛋黄粉15%、酪蛋白5%、胆固醇1.2%、胆酸钠0.2%、碳酸氢钙0.6%、石粉0.4%、鼠维持饲料52.6%)，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2 实验药物和试剂

实验药物：青钱柳叶水提物(无限极中国有限公司提供本科研用)。制备方法：5 kg原料，第一次加12倍水，煮沸保持微沸2 小时，过滤，滤渣再加10倍水，煮沸保持微沸1 小时，过滤合并2次滤液，浓缩干燥成干膏，粉碎过80目筛，干燥保存待用。

链尿佐菌素(美国SIGMA公司，批号：#WXBC2544V)，盐酸二甲双胍(中美上海制药有限公司，0.5 g/片)。柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(索莱宝公司，批号：c1013)。肌酐(creatinine，CRE，批号：20190320)、尿素氮(urea nitrogen，UREA，批号：20190320)、脂质运载蛋白(neutral gelatinase lipoprotein，NGAL，批号：20190320)、肾损伤因子1(kidney damage factor 1，KIM-1，批号：20190320)、铜蓝蛋白(ceruloplasmin，CP，批号：20190320)、丙二醛(malondialdehyde，MDA，批号：20190320)、活性氧(reactive oxygen species，ROS，批号：20190320)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX，批号：20190320)、过氧化氢酶(catalase，CAT，批号：20190320)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD，批号：20190320)试剂盒均购自北京华英生物技术研究所。

1.3 实验仪器

752-迈瑞BS-420全自动生化仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)，华卫德朗DR-200BS酶标分析仪(无锡华卫德朗仪器有限公司)，neofuge 15R型冷冻离心机(heal force公司)，稳豪倍易型血糖仪和血糖试纸(强生上海医疗器械有限公司，生产批号：3677941)。

1.4 动物造模、分组及给药

1.4.1 动物造模与分组 雄性SD大鼠100只，适应性喂养1周，将大鼠随机分为空白组10只和造模组90只。其中空白组给予普通饲料，造模组给予高脂饲料喂养8周。第10周，以30 mg/kg的剂量一次性腹腔注射2 % STZ溶液(现用现配，取适量链尿佐菌素，在0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液冰浴中配置，pH=4.5)，并于 72 小时后禁食不禁水 8 小时，尾尖静脉取血测空腹血糖，选择空腹血糖(fasting bloodglucose，FBG) >11．1 mmol /L 的成模大鼠，造模期间，造模大鼠死亡 10 只，成模 70 只。剔除空腹血糖>30 mmol /L的成模大鼠，剩余 50 只成模大鼠纳入实验。随机分为模型组，二甲双胍组，CPE 低、中、高剂量组，每组 10 只。

1.4.2 给药根据 1 mL /100 g 给药体积计算，空白组和模型组灌胃0.9 %氯化钠溶液，二甲双胍组灌胃二甲双胍混悬液(0.3 g/kg)，CPE低、中、高剂量组分别灌胃青钱柳叶水提物0.25、0.5、1 g/kg，连续给药4周。给药期间各组大鼠给予普通饲料，自由进食、饮水。

1.5 空腹血糖及血清指标检测

开始给药后，每周禁食不禁水8小时，尾静脉采血测空腹血糖。给药4周结束后，禁食不禁水8小时，使用10%的水合氯醛麻醉大鼠，经腹主动脉取全血，血液经3000 r/min离心15分钟取上层血清，采用酶联免疫法测NGAL、KIM-1含量，采用比色法测CRE、UREA、CP、MDA、ROS、GSG-PX、CAT、SOD含量。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 CPE对2型糖尿病大鼠一般体征及FBG的影响

空白组精神状况良好，毛色有光泽，行动自如，反应灵敏；与空白组比较，模型组，毛色晦暗，行为狂躁，反应异常；与模型组比较，二甲双胍组及CPE低、中、高剂量组精神状况有所改善，行为较正常。

与空白组比较，模型组空腹血糖显著升高(P<0.05)。与模型组比较，二甲双胍组空腹血糖显著降低(P<0.05)；CPE低、中、高剂量组空腹血糖显著降低(P<0.05)。见表1。

表1 CPE对2型糖尿病大鼠FBG的影响

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.2 CPE对2型糖尿病大鼠肾功的影响

与空白组比较，模型组肌酐有上升趋势，尿素氮显著升高(P<0.05)。与模型组比较，二甲双胍组肌酐、尿素氮显著降低(P<0.05)；CPE低、中、高剂量组肌酐、尿素氮显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 CPE对2型糖尿病大鼠肾功的影响

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2.3 CPE对2型糖尿病大鼠肾损伤因子的影响

与空白组比较，模型组NGAL、KIM-1、CP显著升高(P<0.05)。与模型组比较，二甲双胍组NGAL、KIM-1、CP显著降低(P<0.05)；CPE低、中、高剂量组NGAL、KIM-1、CP显著降低(P<0.05)。见表3。

2.4 CPE对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响

与空白组比较，模型组MDA、ROS显著升高，(P<0.05)；模型组GSG-PX、CAT、SOD显著降低(P<0.05)。与模型组比较，二甲双胍组MDA、ROS显著降低(P<0.05)；CPE低、中剂量组MDA显著降低；CPE低、高剂量组ROS显著降低(P<0.05)；二甲双胍组GSG-PX、SOD显著升高，CAT有升高趋势(P<0.05)；CPE低、高剂量组GSG-PX显著升高；CPE高剂量组CAT显著升高；CPE低、中、高剂量组SOD显著升高(P<0.05)。见表4。

3 讨论

常规尿蛋白、血尿素氮和肌酐是判断肾脏损伤的传统指标[13]，但是由于早期糖尿病肾病并没有明显的临床症状和体征，所以单凭症状和体征难以及早地发现糖尿病肾病，当血BUN、Cr升高，特别是出现大量蛋白尿时，肾损伤已经相当严重，不可逆转[14]。糖尿病肾损害的早期，良性肾小球动脉硬化尚未出现临床症状，但肾脏储备功能已经下降，肾小球和肾小管的功能和结构已发生改变[15]。研究发现，NGAL是 25 kDa 小分子量蛋白，属于脂质运载蛋白家族成员，可以由中性粒细胞和上皮细胞(包括肾小管细胞) 释放，当肾小管功能损害时，NGAL 释放入血液中，在正常白蛋白尿的极早期能够被检测到，可预测糖尿病肾损害[16]。KIM-1是跨膜蛋白，正常近端小管上皮细胞不表达，肾损伤后 KIM-1 会特异性升高，可作为肾脏近端小管损伤的生物标记物，有利于肾损伤的早期诊断[13]。CP是由肝脏合成的唯一蓝色蛋白质，是一种多铜氧化物及抗氧化剂，可反映机体急性和慢性炎症，与糖尿病肾病进展相关[17]。因此，NGAL、KIM-1、CP是肾小球硬化和肾小管间质纤维化的关键细胞因子[17-18]，可作为早期肾损伤的重要生物学灵敏标志物。

本实验中，与空白组相比，模型组大鼠FBG显著升高，UREA显著升高，CRE没有显著差异但有明显升高趋势，同时模型组大鼠血清NGAL、KIM-1、CP的含量显著升高，表明2型糖尿病大鼠模型已经产生了早期的肾损伤。而其中CRE并没有统计学意义，也说明了在肾损伤早期，传统的肾功指标并不灵敏，这就需要更灵敏的标志物来预测肾损伤，从而加以预防，防止其进一步恶化最终发展为糖尿病肾病，检测NGAL、KIM-1、CP等细胞因子，对于及时发现并预防早期肾损伤具有重要意义。经过给予CPE治疗，CPE低、中、高剂量组都能显著降低FBG、CRE、UREA、NGAL、KIM-1、CP含量，表明青钱柳可以有效降低血糖，改善肾功能，降低肾损伤标志物NGAL、KIM-1、CP的含量，所以青钱柳对于2型糖尿病大鼠的早期肾损伤具有良好保护作用，能够预防糖尿病肾病。

表3 CPE对2型糖尿病大鼠肾损伤因子的影响

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

表4 CPE对2型糖尿病大鼠氧化应激的影响

注：与空白组比较aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05。

2型糖尿病与机体内氧化应激的程度及抗氧化防御体系功能紊乱有关[19]，持续性高血糖诱导机体产生超氧化物如MDA、ROS[20]，同时高血糖还可导致抗氧化酶的糖基化，令CAT、SOD、GSH-PX 等抗氧化酶活性降低，抗氧化系统清除能力减弱，这时机体内大量的氧自由基会损伤周围正常组织蛋白和肾组织，释放NGAL、KIM-1、CP于血液中，并激活糖尿病肾病相关通路，进一步损伤肾脏，使其纤维化，此时肾功能将完全丧失，发展为终末期肾病。本实验中，与空白组相比，模型组ROS、MDA显著升高，CAT、SOD、GSH-PX显著降低，说明2型糖尿病大鼠体内氧化应激水平增强；与模型组相比，CPE低、中高剂量组不仅能显著降低ROS、MDA，还能显著升高CAT、SOD、GSH-PX。结果表明青钱柳可以缓解肾脏的氧化应激损伤，可能通过此途径发挥了早期的保护作用，从而阻碍了肾损伤的进一步恶化，但其具体的作用机制还需进一步深入研究。