SMYD2对心脏成纤维细胞的增殖和胶原合成的影响

孙雪林 张亚同 陈頔 朱愿超 梁良 赵紫楠 胡欣

100730 北京医院药学部 国家老年医学中心 中国医学科学院老年医学研究院

心肌纤维化是以心脏成纤维细胞(cardiac fibroblasts， CFs)过度增殖、胶原异常沉积分布为特征的心脏间质重构[1]。心肌纤维化是多种心脏疾病的共同特征，可使心肌间质沉积大量胶原，导致心室壁顺应性下降，引起心肌收缩力减弱，冠脉血流储备降低。心肌纤维化长期发展易导致心肌缺血复发、心力衰竭和猝死[2]。组蛋白甲基转移酶SMYD2(SET and MYND domain-containing protein 2)属于SMYD家族成员，主要通过甲基化组蛋白和非组蛋白赖氨酸发挥基因调节作用[3-4]。近年研究证实SMYD家族在心脏中发挥了重要作用[5]。目前关于SMYD2在心肌纤维化中作用尚未见报道，本实验通过研究SMYD2对CFs增殖和胶原合成的影响，探讨SMYD2参与心肌纤维化发生的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验对象 原代培养的Wistar乳鼠(≤3 d)原代CFs。购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2016-0006。

1.1.2 构建SMYD2-siRNA 大鼠SMYD2的siRNA应用pGCsilencerTMU6/Neo/GFP/RNAi质粒系统构建(上海吉凯基因化学技术有限公司合成)，针对SMYD2的序列，设计了3个干扰序列，如下：SMYD2-RNAi-1#，CCGTCTCTAGTGCCAACTTTA-CTCGAG-TAAAGTTGGCACTAGAGACGG；SMYD2-RNAi-2#，GCGGAGACAGATCAACTTGAA-CTCGAG-TTCAAGTTGATCTGTCTCCGC；SMYD2-RNAi-3#，CCTGTCAACACACAGGACTTT-CTCGAG-AAAGTCCTGTGTGTTGACAGG。pGCsi.U6/neo/GFP control-siRNA质粒作为对照，对照序列如下：5’-TTCTCCGAACGTGTCACGTTTCAAGAGAA-CGTGACACGTTCGGAGAA-3’。

1.1.3 试剂 改良Eagle培养基(DMEM)/High Glucose1×， DMEM/Low Glucose1(SH30021.01B-240-NWF0419， Hyclone公司)；胎牛血清(FBS)(SV30087.01B-2213-NUC0153， Hyclone， Thermo scientific公司)；胰酶细胞消化液(C0201， Beyotime公司)；EDTA.Na.2H2O(0105-100g， Amresco公司)；2.5% Trypsin 10×100 ml(15090-046， GIBCO， Invitrogen公司)；青霉素和链霉素溶液100× 100 ml(C0222， Beyotime公司)；溴脱氧尿苷(BrdU，Sigma公司)；血管紧张素Ⅱ(AngⅡ， Sigma公司)； 牛血清白蛋白(BSA) 5 g(Roche， 738238， 上海华舜生物工程有限公司)； 汉克平衡盐溶液1×(HBSS)(14170， GIBCO， Invitrogen公司)；胶原酶COLLAGENASE type2 360 U/mg (4176， Worhtington Biochemical Corporation公司)；牛血清白蛋白Albumin bovine(735094-100g， Roche公司)；SMYD2(SAB2103606-100UL，SIGMA-ALDRICH公司)；转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)(sc-146， Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.1.4 PCR引物序列(表1)

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1 CFs培养 取1～3 d龄的Wistar乳鼠，无菌条件下取出心脏，转入预冷DMEM中，将心脏剪碎成大小一致的组织块。移至50 ml无菌离心管中，加入10 ml消化液， 37℃在摇床消化10 min，重复上述步骤，37℃消化10 min，涡旋10 s，在上清液中加入等体积的DMEM 含血清培养基终止消化，4℃保存。将所收集的液体用200目的滤网过滤，2 500 r/min离心3 min，弃上清液，加入10%血清的DMEM培养液，吹打均匀后放入20 cm2细胞培养瓶中置于5% CO237℃孵箱中培育，2 h后心肌细胞贴壁，将含有CFs的上清转移到新鲜培养基继续培养。

1.2.2 Western Blot 将所提取的细胞总蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用湿转法将凝胶电泳分离的蛋白转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。置于含5%封闭蛋白干粉的PBS溶液中，4℃封闭过夜。然后用PBS冲洗膜表面残留蛋白封闭液，根据实验目的，分别加入克隆抗体(SMYD2、TGF-β1)室温孵育NC膜12 h后，使用含0.05% Tween-20的PBS缓冲液冲洗NC膜。使用红外荧光标记抗体避光孵育NC膜1 h，以含0.05% Tween-20的PBS缓冲液冲洗NC膜，最后再用PBS冲洗，以降低背景。Odyssey红外荧光扫描成像系统扫描分析。

1.2.3 qPCR 利用TRIZOL提取细胞RNA，加入20 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水，溶解RNA沉淀。利用反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，反应体系和条件参照试剂说明书，产物于-20℃保存。采用SYBR®Green PCR Master Mix试剂盒操作。SYBR Green Mix 10 μl，检测上/下游引物各1 μl，cDNA 1 μl，Nuclease-Free补足体积至20 μl。反应条件：95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40 个循环，以β-actin为内参照。

1.2.4 MTT法 用胰蛋白酶将培养的CFs消化为单个悬浮细胞，加入10%胎牛血清的DMEM培养液，接种于96孔培养板中，每孔200 μl培养液，含有细胞数大约为103～104，在CO2孵箱中培养细胞。加入AngⅡ和SMYD2-siRNA处理后，培养2～4 d，每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后，将培养板取出，弃掉培养板内液体，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，室温震荡10 min，溶解结晶物。在酶联免疫检测仪上选定490 nm波长测定各孔吸光度值，记录实验结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴描绘细胞增殖情况。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 AngⅡ促进CFs中SMYD2的表达

通过酶消化法和差速贴壁的方法将心肌细胞和CFs分离，分别给予AngⅡ (50 nM和100 nM)作用48 h后，Western Blot检测SMYD2蛋白的表达水平，qPCR检测SMYD2 mRNA表达水平。结果显示AngⅡ促进SMYD2在蛋白和mRNA水平的表达，并且呈剂量依赖性(图1)，提示SMYD2可能参与了CFs的体外增殖过程。

2.2 降低SMYD2的表达可抑制CFs增殖和胶原合成

给予AngⅡ(100 nM)作用后，CFs明显增殖，SMYD2-siRNA则可抑制AngⅡ引起的细胞增殖(图2)。qPCR检测各组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达，AngⅡ(100 nM)可促进其合成和分泌，SMYD2-siRNA则降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达(图3)。

与对照组比较，aP<0.05，bP<0.01(n=4)图1 AngⅡ促进大鼠CFs中SMYD2蛋白和mRNA表达

与对照组比较，aP<0.05；与SMYD2-siRNA组比较，bP<0.05(n=5)图2 降低SMYD2的表达抑制CFs的增殖

与对照组比较，aP<0.05；与SMYD2-siRNA组比较，bP<0.05(n=5)图3 降低SMYD2的表达抑制CFs的胶原合成

2.3 SMYD2对CFs增殖和胶原合成作用的分子机制

在CFs细胞中转染SMYD2-siRNA，结果显示SMYD2-siRNA组TGF-β1蛋白和mRNA表达水平下降(图4)。TGF-β1可促进CFs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的合成和分泌[6]。SMYD2可能通过影响TGF-β1的表达水平参与Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的合成。

与对照组比较，aP<0.05；与SMYD2-siRNA组比较，bP<0.05(n=5)图4 降低SMYD2的表达抑制CFs中TGF-β1蛋白和mRNA水平

3 讨论

本研究的结果表明，AngⅡ可促进体外培养CFs中SMYD2的表达增加，并呈剂量依赖性，因AngⅡ是CFs生长调节的重要生物因子，提示SMYD2可能参与CFs的增殖和胶原合成。CFs的过度增殖、胶原异常沉积分布导致心脏间质重构，促进心肌纤维化的发生，因此SMYD2可能参与AngⅡ促进心肌纤维化发生的过程。实验结果显示，SMYD2能明显增加CFs的增殖，以及Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原 mRNA的表达；SMYD2-siRNA则可降低Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达，表明SMYD2参与了CFs胶原合成。TGF-β1作为CFs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的合成和分泌的重要调控因子，在CFs中过表达SMYD2 同样促进TGF-β1蛋白和mRNA水平增加，SMYD2-siRNA可使其表达水平降低。

AngⅡ诱导心肌纤维化的发生，主要机制是CFs的增殖和胶原蛋白的代谢紊乱及心肌细胞的肥大。AngⅡ可促进CFs向肌成纤维细胞的转化，并且分泌大量的胶原纤维和层粘蛋白等细胞外基质[7]。AngⅡ可以激活CFs细胞表面的L型和T型钙通道，促进CFs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原基因表达增强。心肌纤维化是胶原合成和降解代谢失调的结果，与TGF-β1密切相关。TGF-β1具有调节细胞生长和分化、促进细胞增殖等生物功能[8]。TGF-β1可诱导离体培养的大鼠CFs分泌Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白基因表达增加。因此，降低TGF-β1的表达可明显抑制Ang Ⅱ诱导的CFs的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原分泌，可作为心肌纤维化治疗的一个重要靶点[9]。

表观遗传学修饰异常广泛存在于疾病的发生和发展过程中，其中组蛋白甲基化修饰是研究中的热点，组蛋白甲基化修饰酶参与调控多种细胞生物学功能[10]。SMYD是含有SET结构域和MYND结构域蛋白的家族，是一组重要的赖氨酸甲基转移酶，已证实现有SMYD1-5个家族成员，SMYD主要在胚胎发育、骨骼肌和心脏发育中发挥作用[11-13]。SMYD2对细胞增殖的影响不只是依赖于其对组蛋白甲基化的调控，更与SMYD2广泛调节的非组蛋白底物相关，包括p53、Rb1、PARP1、PTEN、Hsp90和ERα。SMYD2通过对这些底物的甲基化修饰调控这些蛋白的作用，从而发挥其生理和病理功能。SMYD2可将p53 的K371位点甲基化修饰，从而抑制其相邻位点的SET7/9的甲基化。而K370位点甲基化是p53乙酰化并激活下游基因表达的必要步骤，因此SMYD2抑制了p53的生物活性。SMYD2抑制了p53介导的细胞凋亡，这可能是SMYD2参与肿瘤发生的重要机制之一[14]。SMYD2可催化Rb1的K810位点甲基化，该修饰促进了CDK4/CyclinD1复合体对Rb1的Ser807/811位点的磷酸化修饰，进而阻碍了Rb1与E2F的结合，促进E2F对下游基因的激活作用，促进细胞增殖[15]。SMYD2与心血管系统疾病的关系尚未见报道。SMYD2主要在骨骼肌和心肌细胞中表达，对骨骼肌的成熟发挥重要作用，而在小鼠中的研究却发现SMYD2对发育影响较小[16]。

本研究主要证实了SMYD2在AngⅡ刺激的CFs细胞中表达增加，提示SMYD2参与CFs的增殖和胶原合成过程。降低SMYD2在CFs中的表达可明显抑制CFs的增殖和Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1的合成，证实SMYD2参与了AngⅡ诱导心肌纤维化发生的病理过程。但SMYD2对心肌纤维化发生的网络调控机制需进一步深入研究。本研究仅在体外实验证实SMYD2参与调控心肌纤维化的可能分子机制，尚缺乏体内实验的证据，因此需要进一步的体内实验证实SMYD2对TGF-β1调控。此外，在心血管疾病临床转化研究中，SMYD2能否作为新型治疗靶点也是今后研究的主要方向。

利益冲突：无