中介素1-53抑制NLRP3炎症小体减轻多柔比星引起的心肌损伤

蔡晨 吴迪 李朋洋 王斌

100039 北京大学航天临床医学院 航天中心医院心内科(蔡晨、吴迪、王斌)；77030 Houston，Texas Heart Institute(李朋洋)；515041 汕头大学医学院第一附属医院心内科(王斌)

以多柔比星(doxorubicin，DOX)为代表的蒽环类药物是常用的肿瘤化疗药物。但DOX剂量依赖性的心脏毒性严重限制了其使用，对于癌症幸存者来说药物引起的心力衰竭已成为其主要死因[1-2]。蒽环类药物所致心血管并发症包括急性冠状动脉综合征、扩张型心肌病和心律失常等[3]。国际心脏病学会将心脏毒性定义为左室射血分数(left ventricular ejection fraction，LVEF)下降超过10%或LVEF<50%[4]。DOX最具代表性的心脏毒性为左心室舒张末压降低和LVEF受损，导致心脏有效泵血减少，从而引发充血性心力衰竭[5]。

中介素(intermedin，IMD)是2004年发现的降钙素基因相关肽超家族的新成员[6-7]。IMD1-53很可能是体内降解的主要活性片段[8]，对多种心血管疾病有强大的保护作用[9]。Li等[10]发现，IMD1-53水平与非ST段抬高型急性心肌梗死相关；Wu等[11]发现，IMD1-53对败血症大鼠的心脏功能具有保护作用。但是，IMD1-53对于DOX诱导的急性心肌损伤是否具有保护作用尚不清楚。因此，本实验将在DOX诱导的心肌损伤小鼠模型上研究IMD1-53是否具有保护作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8～9周龄雄性C57BL/6J小鼠[(24±2)g]由北京大学医学部实验动物中心提供，动物饲养管理实验操作符合《北京市实验动物管理条例》等法规要求。常规条件饲养，实验前12 h禁食，自由饮水。

1.2 主要试剂

一抗：RAMP1(sc-11379)、RAMP2(sc-11380)、RAMP3(sc-11381)购自Santa Cruz 公司；β-actin购自Abcam公司；NLRP3(D4D8T)购自Cell Signaling Technology公司；caspase-1(C4851)购自Sigma公司；二抗：辣根过氧化物酶偶联二抗购自美国Santa Cruz生物科技公司；IMD1-53购自美国Pheonix Pharmaceuticals 公司；IL-1β Elisa试剂盒购自武汉博士德公司；其他试剂为市售分析纯产品。

1.3 实验分组及模型构建

DOX引起小鼠急性心肌损伤模型：14只雄性8～9周龄C57BL/6J小鼠采用单纯随机抽样分为2组：CON组6只，腹腔注射0.02 ml/g生理盐水；DOX组8只，腹腔注射15 mg/kg DOX。DOX诱导5 d，期间DOX组有2只小鼠死亡。

IMD减轻DOX引起小鼠急性心肌损伤模型：36只雄性8～9周龄C57BL/6J小鼠采用单纯随机抽样分为3组：对照组(CON组)12只，腹腔注射0.02 ml/g生理盐水；DOX组12只，腹腔注射15 mg/kg DOX；DOX+IMD1-53组(IMD组)12只，腹腔注射15 mg/kg DOX和60 nmol/kg IMD1-53。造模第5天时，3组小鼠同时行超声心动图检测(造模前未进行超声心动图检测)。造模7 d后，3组小鼠乙醚麻醉后摘眼球取血，用于进一步Elisa检测；颈椎脱臼处死3组小鼠，取出心脏，用于HE染色及Western blot检测。模型构建期间，6只DOX组小鼠死亡，2只IMD组小鼠死亡。

小鼠骨髓巨噬细胞体外培养DOX引起的NLRP3炎症小体激活模型：由于DOX在体外实验中无法直接激活NLRP3炎症小体，首先用LPS刺激巨噬细胞。实验分为4组：CON组巨噬细胞中不加入任何药物；LPS组巨噬细胞中加入50 ng/ml LPS处理4 h；DOX组巨噬细胞经50 ng/ml LPS处理4 h后再加入10 mmol/ml的DOX诱导8 h；IMD组巨噬细胞经50 ng/ml LPS处理4 h后再加入10 mmol/ml的DOX和10-7mol/L IMD1-53同时诱导8 h。采用Western blot方法检测NLRP3和caspase-1的蛋白含量。

1.4 超声心动图检测

戊巴比妥麻醉小鼠后备皮，应用Vevo770小动物超声仪(Visual Sonics，Toronto，Canada)，探头频率30 MHz，将探头置于小鼠胸骨前，二维超声显示左室短轴切面，于乳头肌水平应用M超声记录左心室运动曲线，测定LVEF和左室短轴缩短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)等指标。连续测量5个心动周期，计算均值。

1.5 心脏质量/胫骨长度比值(HW/TL)测量

将取出的小鼠心脏，用0.9%生理盐水冲洗残余血液，冲洗干净后放在滤纸上吸干水分。使用分析天平测量小鼠心脏质量。取小鼠右胫骨，剥离胫骨上肌肉组织后，用游标卡尺测量右胫骨长度。计算小鼠心脏质量/胫骨长度比值(HW/TL)=心脏质量(mg)/右胫骨长度(cm)。

1.6 HE染色

将小鼠心脏包埋于石蜡块中做石蜡切片并储存于-4℃冰箱。石蜡切片从-4℃冰箱中取出后晾干，浸入苏木精染液5～15 min，自来水洗3～5 min。0.5%～1%盐酸乙醇溶液分化数秒，自来水洗1～5 min。弱碱性水溶液显蓝30～60 s，自来水洗5～10 min。之后蒸馏水洗1～2次。0.5%伊红染色2～3 min，蒸馏水洗1～2次。脱水：80%乙醇30～60 s；95%乙醇30～60 s；无水乙醇1 min；重复无水乙醇1 min。透明：浸入二甲苯1 min；重复浸入二甲苯1 min。中性树胶封固。

1.7 Western blot检测

将准备好的心肌组织加入裂解液(含1 mol/L PMSF)，冰上研磨，在4℃ 1 200转/min离心10 min，取上清。Bradford法检测蛋白浓度，按比例加入5×上样缓冲液煮样，10%SDS-PAGE电泳，200 mA恒流电转转膜，5%脱脂牛奶封闭30 min，TBST洗膜3次，每次5 min，结合相应一抗。放4℃冰箱孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min，结合相应的二抗，室温孵育1 h，用ECL化学发光试剂盒与硝酸纤维素膜孵育后，放入暗盒内曝光，显影后再定影。用Image J软件分析条带灰度值，以β-actin标化，所有实验重复3次。

1.8 Elisa检测

加入样品和标准品，37℃反应90 min。加生物素标记抗体，37℃反应60 min。1×洗涤缓冲液洗涤3次，每次浸泡1 min左右。加ABC，37℃反应30 min。1×洗涤缓冲液洗涤5次，每次浸泡1～2 min左右。TMB 37℃避光反应20～25 min。加入TMB 终止液，用酶标仪在450 nm测定OD值读数。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 DOX引起急性心肌损伤时IMD受体的表达变化

大体形态显示，CON组小鼠的HW/TL为(69.61±1.73)mg/cm，DOX组为(46.49±2.61)mg/cm，后者小鼠心脏明显缩小，HW/TL下降33%(P<0.01)。Western blot结果显示，与CON组相比，DOX组的心肌组织中内源性IMD受体RAMP1和RAMP2的蛋白表达分别升高了5.08倍(图1A)和2.31倍(图1B)(均为P<0.01)，而RAMP3蛋白表达升高了12%(P>0.05)(图1C)。提示在DOX诱导急性心肌损伤的病理过程中，内源性IMD受体系统也发生了变化，因此，内源性IMD参与了心肌损伤的发生。

2.2 IMD1-53改善DOX引起的心脏功能损伤

CON组小鼠1周后生存率为100%，DOX组为50%(6/12)，IMD组为83%(10/12)，与DOX组相比，IMD组小鼠1周生存率提高了33%，提示IMD1-53改善DOX注射后小鼠的生存率。注射IMD1-53后，小鼠心脏大小产生明显变化(图2A)，CON组小鼠HW/TL为(66.80±1.34)mg/cm，DOX组为(42.01±1.17)mg/cm，IMD组为(50.64±1.61)mg/cm。与CON组相比，DOX组小鼠的HW/TL下降37%；与DOX组相比，IMD组小鼠的HW/TL升高20%(均为P<0.01，图2B)，提示IMD1-53改善了DOX引起的心脏缩小。

与CON组比较，aP<0.01(n=6)图1 DOX诱导的小鼠心肌损伤模型中IMD受体系统的表达变化

通过大体形态分析IMD1-53对于DOX引起的心脏缩小的保护作用，小鼠心脏大体标本(A)和通过HW/TL计算出DOX及IMD1-53引起心脏大小变化的量(B)。与CON组比较，aP<0.01；与DOX组比较，bP<0.01图2 IMD1-53抑制DOX诱导的小鼠心脏缩小

超声心动图显示，CON组小鼠的LVEF为53.62%±3.28%，DOX组为31.98%±2.61%，IMD组为46.37%±2.23%。与CON组相比，DOX组小鼠的LVEF下降40%；与DOX组相比，IMD组的LVEF升高44%(均为P<0.01)。CON组小鼠的LVFS为26.35%±2.01%，DOX组为15.07%±1.09%，IMD组为22.73%±1.035%。与CON组相比，DOX组小鼠的LVFS下降43%(P<0.01)；与DOX组相比，IMD组的LVFS升高51%(P<0.05)。提示IMD1-53改善DOX引起的左心收缩功能减低(图3)。

2.3 IMD1-53减轻DOX引起的心肌炎症

HE染色结果显示，相比于CON组，DOX组小鼠心肌间质内有明显的炎症细胞聚集；而相比于DOX组，IMD组心肌间质内的炎症细胞明显减少(图4)。

2.4 IMD1-53抑制NLRP3炎症小体激活

通过Elisa方法检测小鼠血清中IL-1β水平，CON组为(70.28±3.07)pg/ml，DOX组为(100.83±9.84)pg/ml，IMD组为(85.69±0.77)pg/ml。通过Western blot方法检测小鼠心肌中NLRP3和caspase-1蛋白含量。与CON组相比，DOX组的NLRP3蛋白水平升高了18.47倍(图5A)，caspase-1蛋白表达量升高了24倍(图5B)，血清IL-1β水平升高了54.2%。与DOX组相比，IMD组的NLRP3蛋白表达量下降70%(图5A)，caspase-1蛋白表达下降67%(图5B)，血清IL-1β水平下降20.4%。以上提示，IMD1-53通过抑制NLRP3、caspase-1、IL-1β轴，改善了DOX引起的心肌炎症。

进一步通过小鼠骨髓巨噬细胞体外培养验证外源性IMD1-53对DOX引起的NLRP3炎症小体激活的影响，结果显示，与LPS组比较，DOX组的NLRP3蛋白水平升高72.3%(P<0.05)(图6A)，caspase-1蛋白表达量升高91%(P<0.01)(图6B)。与DOX组相比，IMD组NLRP3蛋白表达量下降31.8%(图6A)，caspase-1蛋白表达下降32.4%(P<0.01)(图6B)。Elisa方法检测细胞培养上清液中IL-1β的含量，CON组为(53.51±1.74)pg/ml，LPS组为(528.40±4.22)pg/ml，DOX组为(1 548.16±23.89)pg/ml，IMD组为(904.10±28.41)pg/ml。与CON组相比，DOX组IL-1β上升28.67倍；与DOX组相比，IMD组IL-1β下降41.6%(均为P<0.01)。提示在体外试验中，DOX进一步加重了LPS引起的NLRP3炎症小体激活，而IMD1-53对其产生抑制作用。

超声心动图显示各组小鼠LVEF变化，3组小鼠超声心动图的典型图片(A)、LVEF(B)和LVFS(C)。与CON组比较，aP<0.01；与DOX组比较，bP<0.01，cP<0.05图3 IMD1-53改善DOX引起的心脏收缩功能减退

HE染色显示小鼠心肌细胞和心肌间质炎症细胞聚集(箭头所示)图4 IMD1-53减轻DOX引起的心肌炎症

Western blot分析DOX诱导的小鼠心脏组织中NLRP3(A)和caspase-1(B)的蛋白表达变化。与CON组比较，aP<0.01；与DOX组比较，bP<0.01图5 IMD1-53抑制NLRP3炎症小体激活

3 讨论

DOX作为一线肿瘤化疗药物极大地提高了患者的生存率，但其引起的剂量相关性心脏毒性限制了其使用。目前，临床上多通过早期监测和早期干预来降低DOX引起的心脏损伤。

DOX通过氧化应激、线粒体损伤、DNA损伤、促进细胞凋亡等机制引起心肌受损，最终导致心肌细胞死亡[12]。本研究显示，与CON组相比，小鼠注射DOX后心脏明显缩小，HW/TL降低，心脏中IMD受体RAMP1和RAMP2明显升高，提示IMD可能通过其受体及受体后信号通路产生心脏保护作用；而外源性注射IMD1-53可降低小鼠死亡率，显著改善小鼠心脏的收缩功能。

炎症小体是先天性免疫系统的组成部分，NLRP3炎症小体是心脏组织中表达最广泛的，其在非感染性刺激时可以被激活[13-14]。当DOX引起心肌细胞无菌性损伤时，NLRP3炎症小体被激活，产生大量促炎细胞因子IL-1β分泌到细胞外，从而引发心肌细胞进一步损伤。

DOX引起心肌细胞死亡，这些死亡的心肌细胞产生的细胞碎片所引起的无菌性损伤又被称为损伤相关分子模式，激活NLRP3炎症小体[13]。激活的炎症小体通过释放强效促炎细胞因子IL-1β，进一步加重心肌细胞损伤，从而促进心肌重构和心脏衰竭。

既往研究表明IMD具有抗炎作用，可以抑制炎症反应和氧化应激。其同系物肾上腺髓质素也具有很强的抗炎作用。Li等[15]发现，IMD1-53可以通过降低炎症因子释放、减少氧化应激产物形成来减轻心肌的缺血再灌注损伤；吴迪等[11]研究表明，IMD1-53可以减轻败血症大鼠的心肌损伤；此外也有研究表明，IMD可以通过抑制炎症反应和氧化应激减轻肾病综合征[16]。本研究发现，IMD1-53可降低小鼠死亡率和改善小鼠心脏功能。体内和体外实验同时证实了IMD1-53可以抑制NLRP3炎症小体活化，从而进一步抑制IL-1β的释放，减轻心肌炎症。同时HE染色显示，外源性IMD1-53可减少心肌间质中炎症细胞聚集。这些结果表明，IMD1-53可能通过抑制NLRP3炎症小体激活减轻DOX引起的心肌炎症。

IMD作为强大的心血管系统保护剂，具有抑制氧化应激、抑制内质网应激、抑制细胞凋亡等作用[11]，这些作用很可能也是其抑制DOX所引起的心脏损伤的机制，需要进一步的研究验证。

本研究初步证实了外源性IMD1-53可改善DOX引起的小鼠心脏功能受损，其机制可能与IMD抑制NLRP3炎症小体有关。本研究为减轻DOX心脏毒性提供了新的思路，值得进一步探讨。

本研究验证了IMD可以改善DOX引起的急性心肌损伤，但IMD与DOX引起的慢性心肌损伤之间的关系尚不明确；同时，IMD抑制心肌损伤的同时是否损害DOX的抗肿瘤作用需要进一步研究。

利益冲突：无