氢气对CO2气腹致大鼠肾脏损伤的保护作用及相关机制研究

张建涛 ，蒋丽红，陈明子，王 婷，董奕含，范宏刚

（1.东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省实验动物与比较医学重点实验室，哈尔滨 150030）

与传统手术相比，腹腔镜手术具有视野清晰、出血少、术后恢复时间短等优势，广泛应用兽医临床实践[1]，在动物疾病诊断和治疗过程中发挥重要作用[2-3]。通常需连续向腹腔内注入CO2，提供充足腹腔镜手术空间，手术结束后排出CO2，造成机体缺血再灌注损伤，影响生理功能[4]。肾脏由于血供丰富，最易受影响，缺血再灌注损伤导致的急性肾衰竭已成为腹腔镜手术常见并发症。缺血损害器官，再灌注则导致大量自由基产生，抑制机体的抗氧化防御系统，产生氧化应激损伤[5]。外科手术过程常选择低气腹压灌注和缺血预处理[6-7]，但对减轻气腹对机体损伤效果不理想。

研究指出，氢气具有抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，可显著改善脑缺血再灌注引起的氧化应激损伤[8]，氢气治疗作用在医学领域成为全新的研究方向。因此，本试验探究氢气对CO2气腹引起的肾脏缺血再灌注性损伤的保护作用，并初步阐明其机制，为临床上减轻CO2气腹所致肾脏损伤提供一种可选择的保护方法，促进腹腔镜外科和氢气医学发展。

1 材料与方法

1.1 试验动物及分组

15 只体重250～300 g 雄性Wistar 大鼠，由哈尔滨医科大学试验动物学部提供，大鼠饲喂标准化鼠粮，不限制饮水，试验过程中保持饲养环境不变。

试验动物随机分为3 组，分别为对照组（C）、气腹组（P15）和氢气组（H2），每组各5 只大鼠。C组大鼠仅维持麻醉90 min；P15 组为CO2气腹组，气腹压力维持15 mmHg，时间为90 min；H2组于气腹前10 min皮下注射氢气（0.2 mL·kg-1），10 min后建立CO2气腹，并维持15 mmHg气腹90 min。

1.2 主要仪器与试剂

仪器：紫外分光光度计（美国Thermo 公司），荧光定量PCR 仪（美国Roche，Light Cycler 2.0），成像系统（上海天能科技有限公司，Tanon 5200）

试剂：肌酐（Cr）、尿素氮（BUN）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和过氧化氢酶（CAT）检测试剂盒（购自南京建城生物工程研究所）；PrieScriptTMRT 试剂盒和SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ试剂盒（购自大连TaKaRa 公司）；Trizol 试剂（购自美国Invitrogen）；Nrf2 一抗（购自武汉爱博泰克生物科技有限公司），HO-1和NQO1一抗（购自美国Abcam 公司），Bax，Bcl-2 和Caspase-3一抗（购自沈阳万类生物公司）；HRP-山羊抗兔IgG（购自北京中山金桥生物技术有限公司）：ECL试剂盒（购自碧云天生物技术公司）；其他常规药品及试剂均为国产。

1.3 血液和组织样本采集

放气后2 h断头处死大鼠。收集血样，分离血清并于-20 ℃下保存，用于肾功能检测。取大鼠肾脏，分为3部分，一部分固定于10%福尔马林，制作病理组织学切片；一部分在冷盐水中匀浆，上清液存储于-20 ℃，用于检测肝组织氧化应激指标；第三部分放于液氮中速冻并存储于-80 ℃，用于相关基因和蛋白检测。

1.4 生化分析

根据检测试剂盒说明检测血清中Cr 和BUN 含量及肾脏组织匀浆中氧化应激指标MDA、SOD、GSH、CAT含量。

1.5 组织病理学检查

将固定在10%福尔马林中的肾脏修剪合适尺寸，于包埋盒中流水冲洗过夜，梯度脱水、透明、浸蜡，包埋后切片、脱蜡，HE 染色，光学显微镜观察肾脏组织病理学变化。

1.6 荧光定量PCR

采用qRT-PCR方法开展基因水平检测。Trizol试剂从肾脏中提取总RNA，使用PrieScriptTMRT 试剂盒将其反转录为cDNA。根据产品说明书，使用SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ，在LightCycler 2.0中实时定量PCR。具体引物（见表1）由TaKaRa 合成。反应参数如下：95 ℃持续30 s，45 个循环在95 ℃持续5 s，引物特异性退火温度持续20 s，并在72 ℃延伸20 s。使用2-ΔΔCt方法分析相对mRNA表达。

1.7 蛋白质印迹

将冰冻肾脏组织在RIPA∶PMSF（1 000∶1）裂解液中，充分裂解匀浆。将匀浆于4 ℃下12 000 g离心20 min，取上清，BAC蛋白试剂盒测定上清中蛋白质含量。将每个样品中等量蛋白质（30 μg）加入5×上样缓冲液，100 ℃变性5 min。冷却后，开展后续Western blot试验。

采用Western blot 技术检测相关蛋白表达。按照说明书使用SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒配制凝胶。点样，接通电源，80 V，30 min分离上层胶，120 V，60 min分离下层胶；取出凝胶板，采用湿转方法，300 mA，40～80 V下，将蛋白带转移至NC 膜上；将NC 膜在37 ℃，5%脱脂乳中封闭2 h。将NC膜；置于含有一抗的稀释液中4 ℃孵育过夜，再用二抗HRP-山羊抗兔IgG在37 ℃孵育2 h。使用ECL试剂盒对信号可视化处理，并使用成像系统扫描印迹，imagine Pro-plus 6.0读取蛋白灰度值。

1.8 统计分析

数据表示为平均值±标准差（SD）。使用SPSS 20.0 统计分析。与C 组相比，“*”代表P<0.05；“**”代表P<0.01；与P15 组相比，“#”代表P<0.05，“##”代表P<0.01。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 结果与分析

2.1 血清Cr和BUN水平

与C 组相比，P15 和H2组气腹后血清BUN 和Cr 水平极显著升高（P<0.01）。但与P15 组相比H2组BUN和显著降低（P<0.05，见图1）。

2.2 肾脏组织病理学变化

C 组的肾组织未显示任何明显病理变化（见图2A）。P15 组，CO2气腹导致肾小管上皮细胞周围明显液泡变性（见图2B）；H2组观察到相似组织学变化，但损伤变形程度较小（见图2C）。

图1 血清中BUN及Cr含量Fig.1 Serum BUN and Cr levels

2.3 肾脏组织氧化应激指标变化

与C 组相比，P15 组和H2组血清中MDA 极显著升高（P<0.01），血清中GSH 和CAT 极显著下降（P<0.01），H2 组GSH 和CAT 极 显 著 降 低（P<0.01），SOD 显著降低（P<0.05）；与P15 组相比，血清中MDA、SOD、GSH和CAT均差异极显著（P<0.01，见图3）。

图2 肾脏组织病理学变化（200×）Fig.2 Histopathological changes of kidney

图3 肾脏组织中MDA、SOD、GSH和CAT含量Fig.3 MDA,SOD,GSH and CAT levels in kidney tissues

2.4 Nrf2信号通路基因和蛋白的表达水平

与C 组 相 比，P15 组Nrf2、HO-1 和NQO1 mRNA水平显著上调（P<0.05）；在H2干预气腹过程后，Nrf2、HO-1 和NQO1 mRNA 进一步升高，与P15组相比，差异显著（P<0.05）。蛋白表达结果证实实时PCR结果（见图4）。

2.5 Bax/Bcl-2和Caspase-3基因和蛋白表达

与C 组相比，气腹后Bax/Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 表达极显著增加（P<0.01），H2组Bax/Bcl-2 mRNA 表达显著下降（P<0.05），Caspase-3 mRNA表达显著升高Caspase-3 mRNA；与P15 组，H2组Bax/Bcl-2 和Caspase-3 mRNA 表达差异（P<0.01）极显著。蛋白表达结果验证基因表达结果（见图5）。

2.6 炎性细胞因子基因和蛋白表达

与C 组相比，P15 和H2 组肾脏组织中TNF-α，ICAM-1 和NF-κBp65 mRNA 表达均极显著升高（P<0.01），P15 组IL-10 mRNA 表达极显著下降（P<0.01），而H2组IL-10 mRNA 表达显著下降（P<0.05）；与P15 组相比，ICAM-1 和IL-10 mRNA 表达差异均极显著，NF-κBp65和TNF-α mRNA表达差异不显著（P>0.05）。蛋白表达结果与基因表达结果一致（见图6）。

图4 肾脏中Nrf2、HO-1、NQO1基因和蛋白表达Fig.4 Nrf2,HO-1 and NQO1 genes and proteins expression in the kidney

图5 肾脏中Bax/Bcl-2和Caspase-3基因和蛋白质表达Fig.5 Bax/Bcl-2 and Caspase-3 genes and protein expression in the kidney

图6 肾脏中TNF-α、ICAM-1、IL-10和NF-κBp65基因和蛋白质表达Fig.6 TNF-α,ICAM-1,IL-10 and NF-κBp65 genes and proteins expression in the kidney

3 讨 论

肾脏通过肾动脉由腹主动脉供应血液，血流量大，血供丰富。在腹腔镜手术期间，由于CO2气腹压迫肾脏血管，使肾主动脉、肾段动脉、叶间动脉、肾主静脉、肾段静脉、叶间静脉血液流速明显变慢[9]，肾脏缺血、缺氧，当CO2气腹肖除且血液循环恢复正常时，血液被氧气重新灌注，导致组织和器官缺血再灌注损伤[10]。李维等发现随气腹压升高，肾脏病理组织学在形态上发生改变，肾小管上皮细胞肿胀，影响肾功能[11]。临床上气腹压较高可使肾脏BUN和Cr显著升高[12]。与本试验结果一致，在气腹压15 mmHg 时，造成肾脏功能损伤，但气腹前皮下注射H2干预后BUN和Cr水平得到改善，组织病理结果显示肾小管上皮损伤减轻，说明皮下注射H2可减轻CO2气腹后肾损伤程度。

H2在生物体抗氧化防御机制中具有重要作用[13]。外源H2补充剂可治疗慢性氧化应激相关疾病[14]。Nrf2 及其下游调控基因HO1和NQO1 为调控抗氧化反应的重要基因，在氧化应激损伤中发挥保护作用[15-16]。SOD、CAT 和GSH 通过清除过氧化物和其他自由基，减少脂质过氧化并消除受伤细胞和组织维持氧化及抗氧化平衡。MDA 为细胞膜不饱和脂质过氧化最终产物，为氧化应激敏感指标。试验显示CO2气腹后Nrf2，HO-1和NQO1上调，表明CO2气腹诱导的氧化应激触发体内抗氧化反应，使MDA 显著升高，SOD，GSH 和CAT 含量显著下降，引起肾脏氧化应激损伤。但H2干预后，与气腹组相比，Nrf2，HO-1 和NQO1 进一步显著升高，MDA 显著下降，SOD、GSH 和CAT 含量显著升高，减轻机体肾脏组织氧化损伤。与胡英等N-乙酰半胱氨酸可有效预防长时间气腹诱发氧化应激所致的肾功能损害结论一致[17]。

炎症反应为缺血再灌注损伤机制之一，在缺血再灌注损伤过程中活性氧（ROS）的产生，激活NF-κB 转录因子及炎症细胞因子，包括TNFα，IL-6 和ICAM-1 在内表达上升，IL-10 表达下降[18-19]。TNF-α和IL-6为促炎因子，促进炎症反应发生，IL-10为一种抗炎细胞因子，抑制炎症反应发生，ICAM-1是重要粘附因子，促进炎症细胞和内皮细胞粘附增强，这几种因子共同作用引发炎症反应[20-21]。本试验应用氢气干预气腹过程后，抑制ICAM-1 和TNF-α分泌，增加IL-10 分泌，表明氢气干预气腹具有保护性抗炎作用，可减轻肾脏损伤，保护肾功能。

缺血再灌注可激活肾脏组织内细胞凋亡通路，导致肾脏损伤[22]。Bcl-2 和Bax 为细胞凋亡重要介体，细胞中Bax/Bcl-2 为细胞凋亡指标，其增加代表细胞凋亡。外在凋亡途径由胞质中胱天蛋白酶的活化介导，活化Caspase-3水平为细胞凋亡指标[23]。李维等指出高气腹压力可导致Caspase-3和Bax/Bcl-2 表达升高，使肾脏组织细胞凋亡[11]。陈贝贝等发现缺血预处理后Bax/Bcl-2 显著下降，说明气腹造成的肾脏组织细胞凋亡可以通过预处理得到缓解[24]。本试验也发现Caspase-3 和Bax/Bcl-2 表达升高，说明气腹造成肾脏组织细胞凋亡，H2干预后肾脏组织细胞凋亡缓解。