利用SMART技术构建蒙古柳cDNA-pYES2大肠杆菌文库研究

王馨琪，刘 卉，金光德，南桂仙

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

1 研究背景

蒙古柳[Salixlinearistipularis(syn.Salixmongolica)]又名筐柳，主要分布在中国内蒙古、黑龙江、吉林等地[1]，属于落叶小乔木植物。蒙古柳有很强的抗旱耐盐碱性能，根系发达，有很好的防风固沙的作用[2,3]。研究表明，蒙古柳能生长在pH值9.2以上的盐碱地，是盐碱地土壤改良中起重要作用的野生植物资源[4]。蒙古柳的生长特性决定了体内具有适应逆境的机制，但是对蒙古柳的研究主要集中在形态结构[5]、造林[6]、环境改良[7,8]、栽培[9]、防风固沙[10]和有性繁殖等方面[11]，其基因信息和抗盐性机理方面研究几乎没有报道。本研究对于非模式木本植物蒙古柳的抗逆性分子生物学的研究奠定了实验基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料

植物材料：从安达盐碱地采集的蒙古柳种子。实验常用试剂：SMART试剂盒购自Clontech公司，DNAMarker、GoTaq酶购自TaKaRa公司，所用试剂均为国产分析纯试剂。

2.2 实验方法

蒙古柳种子的无菌消毒和培养条件：蒙古柳种子用常规方法进行表面消毒，种子播在1/2MS固体培养基中培养，培养室温度控制在24℃±1℃，光照时间设置为9 h光照/15 h黑暗，幼苗长出3～4片真叶后取全株。

RNA的提取和质量检测：利用改良CTAB法提取蒙古柳幼苗总RNA[12]。用DNaseⅠ消化DNA。氯仿抽提一次。用无水乙醇和醋酸钠(3 mol/L)溶液进行沉淀，用75%酒精洗沉淀，晾干后加20 μL DEPC水溶解。测定RNA浓度和纯度，用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。

蒙古柳cDNA-pYES2大肠杆菌文库的构建：以1 μg RNA 为模板，按照SMART技术构建cDNA文库的操作方法合成SMART第一链cDNA，然后以其为模板利用聚合酶链反应进行长链PCR扩增，经过15、18、21、24和27个循环后电泳检测，找出合成双链cDNA最优循环次数，用SMART树脂柱对双链cDNA 分级纯化。将纯化后的双链cDNA通过In-Fusion 反应连接到质粒载体PYES2上，将连接产物电转化大肠杆菌感受态细胞JM109。

文库质量检测：第一，测定文库的滴度。取10 μL cDNA文库添加到预热过的1 mL LB培养基中，再从中取10 μL添加到1 mL LB培养基中，这样文库就稀释104。从中取50 μL，涂在LB培养基，第二天计每个平板的菌落数目。计算文库滴度(cfu·mL-1)=(菌落数×稀释倍数)/ 受体菌的体积。第二，重组质粒的PCR鉴定。挑取转化平板上的菌落，通过载体序列设计引物进行PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳检测。上游引物序列：CCGGATCGGACTACTAGCAGCTG；下游引物序列：TAGGGACCTAGACTTCAGGTTGTC。

3 实验结果

3.1 蒙古柳RNA的提取

得到蒙古柳总RNA的OD260/OD280测定值为1.98，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测结果，在紫外灯照射下能够清楚地看到28 s rRNA和18 s rRNA，而且28 s rRNA的亮度大概为18 s rRNA的2倍，两条带之间无弥散现象，说明RNA完整没有降解，提取的RNA质量较好，可以用于cDNA文库构建，如图1。

图1 蒙古柳幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophoresis mapping of total RNA in Salix linearistipularis seedlings

3.2 蒙古柳cDNA-pYES2大肠杆菌文库的构建

以1μg RNA为模板，合成SMART第一链cDNA，以该cDNA第一链作为模板通过长距离PCR扩增，进行15、18、21、24、27个循环，得到双链cDNA，用琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2。

图2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5：通过15、18、21、24、27个 循环次数扩增的双链cDNA的PCR产物电泳检测Fig.2 M：LD5000DNA Marker；1.2.3.4.5： PCR product electrophoresis of double-stranded cDNA amplified by 15, 18, 21, 24, 27 cycles

选择21个循环次数为双链cDNA的PCR最优循环次数。合成的双链cDNA片段长度大部分在0.5～2.0 kb范围内，表明合成的cDNA质量较好。用试剂盒中SMART树脂柱对双链cDNA 进行分级分离，分离产物通过琼脂糖凝胶电泳检测条带大小如图3，将4～8号管中收集的cDNA分离产物用醋酸钠沉淀后纯化cDNA。

图3 双链cDNA分级分离Fig.3 Double-stranded cDNA hierarchical isolation

3.3 cDNA质量鉴定

将蒙古柳cDNA文库连pSMART载体电转化到大肠杆菌感受态细胞，每个平板长出2 000多个单克隆。根据文库滴度测定方法，每个培养基长出30个单克隆，测定培养基中原始文库滴度为6×106cfu·mL-1。从培养基上长出的大肠杆菌中任意挑选16个单克隆进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示如图4。

图4 cDNA文库插入片段的PCR检测Fig.4 PCR detection of cDNA library insertion fragments

从图4看出，大肠杆菌中插入的片段大部分在0.5～2.0 kb，平均长度为0.8 kb，重组率接近100%，基本上每个菌中都转入了蒙古柳基因，得到了蒙古柳cDNA-pYES2大肠杆菌文库。

4 讨论

利用SMART技术构建cDNA文库是产生高质量cDNA可靠的方法。SMARTcDNA合成技术是基于PCR的方法构建cDNA文库，它被设计为优先富集全长cDNAs。采用LD-PCR 技术扩增双链cDNA 的第二条链，仅具有SMART锚定序列的5′端的那些SS的cDNA可以作为模板被成倍扩大，不完整的cDNA和基因的聚A-RNA的转录会缺乏SMART锚，不会被扩大，因此污染的基因组DNA和聚A-RNA被消除。这种选择性扩大，可以构建cDNA文库具有高比例全长克隆。利用SMART树脂柱对cDNA 进行分级分离，可有效除去小片段的cDNA。

文库滴度、重组率和插入片段的大小是鉴定cDNA文库质量的标准。本实验中这些数据说明得到的cDNA能满足构建文库要求。蒙古柳cDNA文库的构建为耐盐基因的挖掘和揭示耐盐分子机制奠定了基础。