一种黑木耳棚室栽培病害病原菌鉴定

刘佳宁，马银鹏，张丕奇，马庆芳

(黑龙江省科学院微生物研究所，哈尔滨 150010)

木耳(Auriculariaheimuer)[1]别名黑木耳、光木耳，其子实体胶质，色泽黑褐，质地柔软，味道鲜美，营养丰富，同时具有很高的药用价值，是世界公认的高营养保健食品。我国木耳栽培规模逐年扩大，木耳产业已经成为东北部分地区的主导产业，在农业总产值中占有较大比重[2]。

近年来，随着国家脱贫攻坚战略的实施，很多贫困地区将农产品产出比较高的食用菌栽培项目作为脱贫的主要手段进行推广。棚室栽培黑木耳由于其具有占地面积小、资金投入少、商品产出比高等特点，已成为食用菌栽培项目中的主要品种。黑龙江省勃利县境内的多个黑木耳栽培项目纷纷上马，项目实施过程中，由于栽培经验不足，对栽培环境的控制不到位，会发生温度过高、湿度过大和棚内通风不良等现象，为黑木耳病害的聚集和发生创造了条件。从黑龙江省勃利地区采集病原菌样品，根据科赫法则的基本步骤进行了一系列分离培养、病原菌回接和形态及分子生物学鉴定等试验，确定了该病原菌的分类地位，为后续防治奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 病害调查与病原菌菌株获取

采集具有典型病害特征的样品进行分离培养获取纯病原菌菌株。该病害的典型特征为：在菌袋内和黑木耳子实体上形成白色的丝状覆盖物，初期极其薄弱，当温度和湿度增加后，白色的丝状覆盖物迅速增加，严重时可覆盖整个黑木耳子实体表面，及时晒干黑木耳子实体，白色丝状覆盖物也不会消失，仍与黑木耳子实体紧密结合。当这种病害发生以后，黑木耳子实体的色泽变黄，耳片边薄，产量下降较为明显(如图1所示)。

在黑龙江省勃利县五处黑木耳种植场采集具有明显病症的标本6株，经形态鉴定后均为未知病原菌(Unknown pathogen)。

1.2 实验室复制病害典型特征

根据科赫式法则，将分离出的病原菌与黑木耳进行回接试验(试验所用木耳菌为 “黑威29”，由黑龙江省科学院微生物研究所提供)，定期观察，记录发病情况。经过2周的培养后，黑木耳子实体上出现了与病原地所采集样品同样的发病特征。

1.3 培养基配方

第一，改良PDA培养基。配方为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g、磷酸二氢钾3 g、硫酸镁1.5 g、水1 000 mL。

图1 病原菌附着在黑木耳菌袋和子实体上Fig.1 Pathogens attach to bags and fruiting bodies of Auricularia heimuer

第二，MEA培养基(上海古朵生物科技生产)。

1.4 形态鉴定

用接种针将病原菌挑入盛有改良PDA培养基平板中央，置于25℃恒温箱中培养，获得纯菌落。间隔24 h测量菌落直径，观察外观形态变化及颜色等直至菌落长满平板为止，记录相关数据。用接种针挑取适量培养基、菌丝及其产物，置于载玻片的无菌水中，盖好盖玻片后直接在显微镜下观察照相并测量。

1.5 菌丝体培养及DNA提取

将菌种活化后接种于液体PD培养基中，25℃浅层静置培养3～5 d，收集菌丝，滤纸吸干后-20℃保存。采用CTAB 法提取DNA，DNA 提取物于-20℃冰箱贮藏备用。

1.6 ITS序列比对与分析

对未知病原菌unknown pathogen进行ITS 序列的扩增。引物为ITS1-F：5′- CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA -3′、ITS4-：5′- CAGGAGACTTGTACACGGTCCAG -3′。引物由大连宝生物有限公司合成。PCR反应在Gene Amp PCR System 9700 PCR仪上进行扩增，20 μL的反应体系内各种成分反应体系见表1。扩增程序见表 2。测序由上海生物工程有限公司完成。

表1 ITS序列扩增反应体系表Tab.1 ITS sequence amplification reaction system

表2 扩增程序设置表Tab.2 Settings for amplification procedure

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

2.1.1 菌落形态

在MEA培养基上的菌落在7 d内达到73～75 mm。气生菌丝白色，致密，棉质，表面白色，反面白色。

在PDA培养基上的菌落扩散非常快，在7 d内达到82～84 mm。气生菌丝白色，较为稀疏，绒毛状，表面白色，3周后菌落表面呈现极淡紫色。

2.1.2 菌丝及孢子形态

在气生菌丝体中产生的分生孢子，长度不定，分支分隔，每个芽枝都有一个分生孢子。分生孢子长见椭圆形到宽椭圆形，很少见亚球形，0-1分隔，10-18×7-10 μm。

该菌形态特征与已知真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)基本一致，初步确定该菌株为真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。

2.2 序列分析

2.2.1 ITS扩增结果及分析

测序结果显示，供试菌株ITS 序列为499 bp，如下：

菌株的ITS 序列已提交GenBank，接受号为HM573930。

2.2.2 ITS序列系统发育分析

用已经获得的未知病原菌ITS序列在GenBank中比对，与相似度最高的7个不同种建立进化树，7种序列名称及GenBank号见表3：

表3 相似度较高的7个种的ITS 序列名称及号码表Tab.3 ITS sequence name and number list of 7 species with high similarity

图2 未知病原菌(unknown pathogen)与相似度 较高的7个品种的系统发育树Fig.2 Phylogenetic trees of unknown pathogens and seven species with high similarity

由图2可知，各分枝内菌株间的最大遗传距离较大。其中病原菌(unknown fungi)与已知种HypomycesmycophilusGenBank编号KU937111.1的序列遗传距离差异为0.0000，经比对后其相似度为99%，结合宏观经典分类学数据进一步确定该病原菌为真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)其生物学分类为：子囊菌门 (Ascomycota)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、肉座菌目(Hypocreales)、肉座菌科(Hypocreaceae)、菌寄生菌属(Hypomyces)、真菌菌寄生(Mycophilus)。

3 讨论

根据形态学及分子生物学方法鉴定，将病原菌确定为真菌菌寄生(Hypomycesmycophilus)。该真菌在我国最早的记录是2017年，由中国科学院曾昭清[2-3]等发现的我国新纪录种。菌寄生属主要以寄生的方式生在其他真菌的子实体上，这也符合黑木耳栽培中真菌菌寄生以黑木耳子实体为寄主的实际情况，利用黑木耳子实体及其栽培环境为自身生长提供条件。在棚室栽培黑木耳的中期，比较容易遇到高温天，在高温、高湿且栽培大棚通风较差的情况下，病原菌真菌菌寄生极易生长，造成病害的大规模发生。由于黑木耳本身的生长、生殖所需要的营养、温度、湿度、pH、水分等基础条件与真菌菌寄生所需条件有巨大的交集，因此对真菌菌寄生病害的防治造成较大困难，希望通过后续研究能够找到应对该病害的合理措施。