ELISA法检测中药材及中药饮片真菌毒素的探讨

柯 颖，徐昕怡，洪小栩*

(1 中国药科大学，南京 210009；2 国家药典委员会，北京 100061)

随着我国中医药产业的快速发展，中药材与饮片使用人群范围日益扩大，市场需求不断增长。由于产地分布广、加工企业多、制备工艺各异及成分复杂多变等，给中药材与饮片的质量控制带来极大的挑战，保障中药材与饮片安全性显得尤为重要。中药材与饮片的安全性问题，涉及内源性有毒成分和外源性有毒有害物质污染。内源性安全考虑主要针对中药自身含有的毒性成分，如生物碱类、苷类、萜类、金属元素类等，可引起肝损伤、肾毒性、呼吸系统损害等不良反应。有毒中药材与饮片治疗窗较窄，在临床用药方面有一定的风险，需要严格控制这些已知毒性成分的含量。外源性污染主要涉及重金属及有毒有害元素、农药残留，特别是有机氯类农药，此类物质可在人体内累积，对人体的正常功能造成伤害。中药材与饮片微生物污染问题也不容忽视，特别是在生产以及加工储运过程中，如不采取有效措施加以控制，极易造成外源微生物的污染，其中可能存大量致病菌和某些真菌毒素，导致中药材与饮片存在一定的安全性风险隐患，给临床使用带来安全性问题。

1 真菌毒素污染控制

中药材与饮片的种植、采收、炮制、运输、贮藏等各环节都有可能引入或加重真菌毒素的污染。研究发现，目前存在150余种真菌，可产生的真菌毒素约有400种，其中约有200种可对人和动物造成危害[1]。这些真菌毒素一般表现为慢性毒性和协同性，毒素在人体内能够累积，造成DNA损伤，具有致癌性、致突变性或致畸性等，一旦摄入将严重威胁到人类生命健康[2]。世界卫生组织(WHO)已将黄曲霉毒素(Aflatoxins, AFT)认定为 ⅠA 级危险物，其中毒性最强的黄曲霉毒素B1(AFB1)半数致死量为0.36 mg/kg体重[3]。根据联合食品添加剂专家委员会(JECFA)规定的每日耐受摄入量[tolerable daily intake, TDI，μg/(kg·d)]，玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)、伏马毒素(Fumonisins, FB)、赭曲霉毒素A(Ochratoxin A, OTA)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)的TDI分别为0.2、2.0、17.1和1.0 μg/(kg·d)[4]。

为保障中药材、饮片或植物药使用安全，各国都极其重视对真菌毒素污染的控制。中国、日本和欧洲等药典均对易霉变的中药材与饮片制定了相应真菌毒素检测方法和限量标准，在控制种类上主要是针对真菌毒素中毒性较大、危害性较高的AFT、ZEN、FB、OTA和DON等(见表1)。

表1 国内外药典对真菌毒素检测的收载情况

①:AFs=AFB1+AFB2+AFG1+AFG2；
②：*、**、***和****分别表示测定相应品种AFT、ZEN、FB和OTA的含量。

目前，国内外普遍采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)以及高效液相色谱-串联质谱法(high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS)检测毒素(见表2)。《中国药典》2015年版在采用HPLC法基础上，增加HPLC-MS检测技术，进一步强化检测手段，提升检测能力，可检测60余种真菌毒素。

表2 中药材真菌毒素检测方法比较

2 真菌毒素的检测(ELISA法)

酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法是基于免疫学建立的检测技术。其原理是抗原与抗体的特异性结合。将抗原或抗体吸附在固相载体表面，抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，根据加入底物显色程度进行结果判定[5]。ELISA法由于灵敏度高，特异性好，大分子蛋白质类物质可作为抗原免疫动物来获得特异性抗体，因此在生物药检测领域广泛应用。ELISA法可分为6种类型(见表3)，其中常用的是双抗原夹心法和间接法。一般小分子物质不具有免疫原性，不适宜ELISA法建立。真菌毒素相对分子质量低且仅含单个抗原决定簇，属于半抗原。但将真菌毒素通过共价键与大分子载体蛋白偶联[6]，可形成全抗原，用于制备高特异性的单克隆抗体，使得ELISA法用于真菌毒素的检测成为可能。

表3 ELISA法的检测方法分类

ELISA法检测灵敏度可达到pg级别，具有操作简便、检测时间短、检测通量大、对检测环境和设备要求不高的特点，更适合中药材与饮片中真菌毒素检测的实际需求[7]。

3 ELISA法与HPLC法比较

HPLC法是各国药典普遍采用的真菌毒素检测方法。其原理是以高压条件下的液体为流动相，并采用固相萃取柱的色谱分离技术，以反向高效液相色谱法最为常用[8]。通过计算色谱峰的面积来确定其含量。近年来，HPLC-MS或LC-MS/MS检测由于具有极强的特异性已被用于多种真菌毒素的检测[9]。

ELISA法与HPLC法在前处理和检测过程中对供试品的处理和操作不同，对测定结果的影响程度也有所差别。针对真菌毒素检测方法的应用，目前也有不少研究机构采用ELISA法检测试剂盒与HPLC法进行比对，以进一步对ELSIA法在真菌毒素检测的适用性进行评估。

3.1 供试品的前处理

合理的前处理过程是检测可靠性的前提。由于真菌毒素残留水平较低，中药材与饮片种类繁多，基质复杂，且其来源及生产企业加工处理方式各异，无论采用哪种检测方法，无疑都将面临极大的挑战。前处理技术主要包括真菌毒素的提取、纯化、富集等过程。提取溶剂的选择主要取决于待测毒素的种类、性质以及待测毒素在提取溶剂中的溶解度和非测定成分在提取溶剂中的分配系数，以便最大限度地提取目标毒素。真菌毒素一般在酸性或中性条件下稳定，所以通常需要提高溶剂体系中水相的pH值。常见的提取方法有一步提取法、QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe)法、加速溶剂萃取法等。一步提取法具有操作简单、成本低等特点，但是易引入杂质，适用于灵敏度较高、对供试品前处理要求较低的质谱检测方法。QuEChERS法是近年来国际上最新开发的一种农产品检测的快速样品前处理技术,其有机试剂用量少，准确度和精密度高，可实现对中药材与饮片多种真菌毒素的同时提取和净化，适用于同一药材多种真菌毒素的同时检测。

纯化与富集过程是为了获得更高的选择性和灵敏度，除去干扰杂质(如脂类、蛋白质、色素等)，保留待测组分。目前常用的纯化方法有免疫亲和柱净化法、固相萃取柱净化法及柱色谱法等，其中免疫亲和柱法净化特异性强，纯化效果好，因此应用最为广泛[10]。ELISA法与HPLC法前处理过程的比较见表4。

表4 ELISA与HPLC两种方法在供试品前处理过程的比较

3.2 方法比较

已有相关文献报道，采用ELISA法和HPLC法对加标检测供试品中真菌毒素的含量进行测定，通过供试品回收率统计结果比对，对两个方法的准确性和抗干扰性进行综合评估(见表5)。

表5 ELISA法与HPLC法测定真菌毒素回收率结果的对比[11-16]

从发表文献的数据结果看，对于某些药材，ELISA法的回收率和精密度结果与HPLC法检测结果基本接近，有些检测供试品的回收率甚至高于HPLC法，说明ELISA法具有较好的特异性。回收率和检测偏差总体均在可接受范围之内，可用于中药材与饮片真菌毒素的检测。

ELISA法存在的供试品回收率超过100%的情况，表明供试品在前处理和分析过程中损失较少，也有可能存在供试品内源性和外源性物质干扰，或者存在一定程度的同类型毒素免疫交叉反应。HPLC法的回收率偏低可能是由于供试品提取液经免疫亲和柱纯化后有损失，或者是柱后洗脱时，没有处理好控制流速，造成洗脱不完全[17]。在结果准确度的比较上，总体上，HPLC法的精密度比ELISA法高，说明HPLC法的重复性好，准确度较高，稳定性好。

3.3 应用的考虑

针对检测供试品干扰因素的不确定性，ELISA法应建立适用性评估技术要求，以保障检测结果的可靠性和稳定性。一是，建立适用性评估方法，供试品在检测前应通过检测加标回收率，确定干扰是否可接受的范围，对供试品的方法适用性进行确认。对内源性或外源性物质干扰较大的供试品，可能存在不适用的问题。二是，为进一步加强检测结果的可靠性，可根据每次检测供试品加标回收率，建立相应的干扰影响系数，对检测结果进行纠偏，排除干扰。三是，进一步完善和优化供试品前处理，包括采用固相萃取柱，并优化洗脱条件及相关参数设置。四是，规范正确的操作，减少人为误差，保障结果的可靠性。

4 应用前景

随着当前药品全生产链条、全生命周期管理的理念的发展，加强源头和生产过程的检测，最大程度避免和降低中药材与饮片中真菌毒素的残留至关重要。建立简便快捷、经济实用、成本低廉的检测方法显得尤为必要。虽然目前中药材与饮片真菌毒素的检查还是以色谱法为主，但是这些分析方法操作复杂，设备昂贵，检测环境要求高，检测效率低，检测成本高，而且检测人员要熟悉仪器的操作，不适于大量样品的筛查及快速检测，制约了真菌毒素控制的实际应用。《中国药典》2020年版拟纳入真菌毒素检测ELISA法，为有效控制中药材与饮片真菌毒素污染又提供了一种技术选择。

ELISA法的应用为未来中药材与饮片真菌毒素快检和筛查提供了广阔的发展前景。免疫胶体金技术是近年来在酶联免疫法的技术基础上发展起来的一种新型快速检测技术[18]。胶体金技术包括胶体金标记技术、免疫技术和固相层析技术[19]。当免疫胶体金颗粒遇到相应的真菌毒素抗原时会发生反应，产生聚集，在适宜的条件下达到一定的密度，可产生肉眼可见的颜色[20]。免疫胶体金技术适用于现场大通量快速检测，样品处理简单，5～10分钟就可以看到检测结果。胶体金试纸条作为定性检测，操作简便、快捷，无须昂贵设备，操作人员不需要进行特殊培训、检测成本更加低廉，可应用于中药材及中药饮片真菌毒素的初筛检测，极大方便了基层的实际应用和质量控制[21]，在实际监测中更具实用价值。

5 小结

我国的中药材与中药饮片市场急需进行规范管理，制定严格、完善的中药质量标准也刻不容缓。要实现中药产业的高质量发展，必须从源头抓起，首先要提高中药材质量。ELISA技术运用于中药材质量检测的发展，为中药材质量检测提供了一种重要手段。ELISA法简便、快速，检测覆盖面大，节约了大量的人工成本，常用于定性分析和前期的大量初筛；免疫胶体金技术以其特异性强，检测高效，作为高通量检测方法，可用于现场筛选大量样品，在中药材及中药饮片质量控制领域显示出广阔的应用前景。生产企业和监管机构可根据实际需要，采用新手段对中药材与饮片进行风险评估。