木犀草素抗骨性关节炎潜在靶点的筛选与鉴定

徐强 李海燕 金刚

1.台州恩泽医疗中心（集团）恩泽医院 浙江,台州 318053 2.台州恩泽医疗中心（集团）路桥医院

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的关节病，随着年龄的增长，发病率越来越高，65岁以上中老年人群50%以上有OA的X线表现[1]。OA也是造成中老年人群骨关节疼痛和致残的主要原因，其影响整个关节结构，包括关节软骨、软骨下骨、韧带、滑膜、关节囊及关节外肌肉，导致关节软骨退变，最终发生关节畸形和功能丧失，严重降低了中老年人的生活质量，因而备受临床重视[2-4]。目前，OA尚缺乏特效药物，主要通过药物干预、饮食调控和运动疗法控制症状，因此寻找有效防治OA的药物具有重要的临床意义。中药化学成分多样，药物活性物质丰富，从中药中开发OA新药具有广阔的发展前景。

既往研究表明，骨碎补对OA具有良好的治疗作用[5]。从骨碎补中分离出来的木犀草素（结构式见图1）能够抑制脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的巨噬细胞激活，并能拮抗炎症因子，从而发挥抗OA的作用[6]。木犀草素还具有良好的抗炎、抗氧化、抗肿瘤以及抗菌活性，除了OA外，临床还用于治疗重症急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）、肝炎、心血管疾病等[7-9]。骆帝等[10]对骨碎补治疗OA进行了系统的网络药理学研究，提示木犀草素是治疗OA的有效成分之一，但是对于木犀草素治疗OA的相关机制尚未深入研究，因此木犀草素的作用机制和治疗靶点仍不清楚。计算钓靶法是采用计算方法将化合物、生物活性和疾病靶点信息联系起来，通过识别生物活性小分子与疾病之间的相互作用蛋白，探索小分子对于疾病的作用机制，加快新药开发的一种方法[11-13]。计算钓靶法能显著改善药物研发成本高、速度慢、效率低以及所需样品量大等问题，有利于缩短新药开发周期，因此本研究采用计算钓靶法对木犀草素抗OA的潜在靶点进行了筛选与分析，现报道如下。

图1 木犀草素化学结构Fig.1 Chemical structure of luteolin

1 材料和方法

1.1 材料 所用的数据库包括PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、中药系统药理学数据库及分析平台 （Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、人类孟德尔遗传 （Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库（http：//www.omim.org/）、比较毒物遗传学数据库 （The Comparative Toxicogenomics Database，CTD）（https：//ctdbase.org/） 和药物靶标数据库 （Therapeutic Target Database，TTD） （http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）。所用服务器包括：Swiss TargetPrediction服务器（http：//www.swisstargetprediction.ch）、药物再定位和药物不良反应预测 （predict drug repositioning and adverse drug reaction，DRAR-CPI）服务器 （https：//cpi.bio-x.cn/drar）及分子对接服务器（http：//www.dockingserver.com/web/docking）。

1.2 方法

1.2.1 药理参数和分子特性评价 首先通过TCMSP数据库对木犀草素体内代谢的吸收 （absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）及排泄（excretion）过程（缩写为ADME）以及分子特性进行评价。

1.2.2 DRAR-CPI靶向蛋白预测 DRAR-CPI服务器可以通过分析蛋白质的相互作用来预测化学成分的靶向蛋白。从PubChem数据库下载木犀草素（Pub-Chem CID：5280445）的sdf文件，将其上传到DRARCPI服务器，参数为默认值，筛选Z'值（Z'-score）＜-0.5的靶向蛋白。

1.2.3 Swiss TargetPrediction靶点预测 登陆Swiss TargetPrediction服务器，采用Marvin for JavaScript Version 6.1绘制木犀草素结构，对其进行靶点筛选。

1.2.4 木犀草素抗OA靶点预测 将DRAR-CPI及Swiss TargetPrediction服务器共同预测到的木犀草素靶向蛋白作为潜在靶点信息，并与OMIM、CTD和TTD数据库中已报道的与OA相关的疾病靶点进行匹配，选择既是木犀草素靶向蛋白又是OA靶点者进行后续分析。

1.2.5 分子对接 首先将1.2.1和1.2.2涉及到的相关蛋白的蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）ID输入到分子对接服务器（https：//www.dockingserver.com/web/docking），再将木犀草素的sdf文件上传到服务器，点击开始对接，并对结果进行分析。

2 结果

2.1 药理参数和分子特性评价 掌握化合物的药理参数与特性有助于深入了解该化合物的成药性能，明确合适的剂型，能够减少药物研发前期的筛选操作。木犀草素口服生物利用度（oral bioavailability，OB）为36.16%，大于30%；药物相似度（drug-likeness，DL）为0.25，大于0.18；可旋转键数 （number of rotation bonds，RBN）为1，小于10，表明木犀草素口服吸收较好，具有较好的成药性[14]。而半衰期（half-life，HL）为15.94h，半衰期较长，能维持长时间的疗效，可以考虑制成一般口服制剂。木犀草素的分子量（molecular weight，MW）为286.25Da，小于500Da；油水分配系数（ACD oil water partition coefficient,AlogP）为2.07，小于5；氢键供体（hydrogen bonding donor，Hdon）为4，氢键受体（hydrogen bonding acceptor，Hacc）为6，均接近5，符合Lipinski五规则[15]，成药可能性较高。

2.2 靶点预测 从Swiss TargetPrediction服务器筛选得到木犀草素的相关靶点15个；通过DRAR-CPI共筛选出389个靶向蛋白，其中Z'值＜-0.5的靶向蛋白共有273个，Z'值＜-0.5表明具有良好的靶向性；通过上述从Swiss TargetPrediction服务器和DRAR-CPI筛选到共有靶点6个。见表1。

将“osteoarthritis”分别输入到CTD、OMIM以及TTD数据库中，从CTD筛选到118个靶点蛋白，OMIM筛选到65个靶点蛋白，TTD筛选到21个蛋白，其中共有疾病靶点183个，将表1中的6个靶点蛋白与疾病靶点进行匹配，发现既是分子靶点又是疾病靶点的蛋白有2个，分别为MMP1和MMP3，具体筛选流程见图2。

表1 Swiss TargetPrediction和DRAR-CPI筛选的木犀草素共有靶点Tab.1 Optimization of targets of luteolin by Swiss TargetPrediction and DRAR-CPI

图2 木犀草素靶标鉴定流程图Fig.2 Flow chart of target identification of luteolin

2.3 分子对接 采用dockingserver分子对接服务器对木犀草素和相关靶点蛋白进行分子对接。木犀草素与MMP1对接过程中抑制常数（inhibitory constant，Ki）=53.79μmol·L-1，自由结合能为-5.82kcal/mol；与MMP3对接过程中Ki=1.68μmol·L-1，自由结合能为-7.88kcal/mol。见表2。自由结合能小于-5kcal/mol，证明化合物与靶点具有较好的结合能力[16]，计算结果表明木犀草素具有结合MMP1和MMP3的能力。

木犀草素与MMP1的疏水相互作用残基包括His218、Glu219、Asa180和Tyr210； 木犀草素与MMP3的疏水相互作用残基包括Leu164、His224、Tyr220、His201、Phe232、Glu202、Tyr223、Ala200、Val198、Leu218和Leu197。见图3。表明木犀草素可能通过这些关键残基与MMP1和MMP3产生交互作用，从而发挥相应的药效。

3 讨论

OA是一种以关节软骨退化为特征的关节疾病。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一种锌依赖性蛋白酶，它不仅在细胞外基质（extracellular matrix，ECM）分解过程中起着关键作用，而且对于关节炎和肿瘤侵袭等病理过程也具有重要意义[17]。炎症过程中滑膜细胞释放的多种炎症介质，如细胞因子、趋化因子、生长因子及MMPs等，均可能与OA疼痛有关；促炎细胞因子白细胞介素-1和肿瘤坏死因子-α通过释放MMPs和细胞因子等下游炎症介质，在介导疼痛中发挥关键作用[18]。MMP1是一种分泌型金属蛋白酶，能催化OA中基质胶原的裂解，并能作用于白细胞介素-1β等细胞因子，其表达水平与OA软骨病变的严重程度一致；由MMP1作用产生的尿胶原降解产物也与OA疼痛有关，它可以提高滑膜周围神经的敏感度，从而加重患者软骨损伤的疼痛症状[19]。MMP3是MMP家族的一员，是ECM联合调节剂，参与疾病发生、伤口愈合、组织修复和重塑[20]。研究发现，类风湿关节类患者关节滑膜细胞和滑膜组织中MMP3过表达，且其表达水平与病情严重程度呈正相关，抑制MMP-3的mRNA和蛋白表达，能够起到保护软骨、治疗类风湿关节类的作用[21]。木犀草素与MMP1和MMP3能够较好地结合，故笔者推测其能下调MMP1和MMP3表达，防止软骨降解，促进新合成的ECM的积累，并抑制滑膜成纤维细胞增殖，最终缓解OA的炎症反应。

表2 木犀草素与MMP1和MMP3相互作用的分子对接数据Tab.2 Docking data of luteolin interacting with MMP1 and MMP3

图3 木犀草素与MMP1和MMP3的分子相互作用Fig.3 Molecular interacting of luteolin with MMP1 and MMP3

综上所述，本研究通过计算钓靶法证实MMP1和MMP3是木犀草素抗OA的潜在靶点。但本研究还存在以下不足：计算钓靶法作为一种系统研究药物机制的新工具，虽然可以节约资源，减少筛选实验，有利于快速、有效地找到药物靶点，但是靶点预测主要依赖于现有的大数据，由于算法的不足，故还无法确定木犀草素抗OA的潜在剂量效应结果；而且预测的靶点尚缺乏体内和体外实验的依据，因此下一步将针对以上靶点进行深入研究。