多级孔ZrO2材料对牛血红蛋白的吸附性能研究

强涛涛， 宋云颖， 朱润桐， 娄 贞

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021； 2.中国农业机械化科学研究院 , 北京 100083)

0 引言

随着生物技术的发展，蛋白质组学被广泛地应用于生物医药、基因诊断等领域[1]，而蛋白质的分离与纯化是蛋白质精细研究的先决条件.目前，已经有众多方法应用于蛋白质的分离和纯化，如色谱法、超滤法、吸附法、凝胶电泳法等[2-4].

二氧化锆(ZrO2)是一种无毒、具有较高的生物相容性的过渡金属氧化物，拥有独特的物理、化学性能，如高熔点、高硬度、高化学稳定性、良好的耐磨性和耐蚀性[5,6].同时，ZrO2还是一种P型半导体，易于产生氧空穴，具有良好的吸附作用，被广泛的用作非均相催化剂、吸附剂、化学传感器、固体氧化物燃料电池、电子材料等[7].自1998年Yang等[8]合成了具有大孔-介孔结构的金属氧化物，多级孔材料就吸引了众多研究学者的关注.与单一孔结构的多孔材料相比，多级孔结构材料拥有相互连通的孔道结构、较大的比表面积、暴露的活性位点[9,10]等优异的性质.因此，制备一种具有多级孔结构的ZrO2材料可以作为一种有效的吸附剂，用于分离纯化蛋白质.

模板法[11,12]是常用的合成多级孔ZrO2材料的方法之一，但是目前用于合成多级孔材料的方法具有一定的不足，例如合成过程繁琐、模板剂价格高、污染严重[13]等.因此，寻找一种简便、环保的方法合成多级孔ZrO2具有重要意义.

本课题创新性的将三嵌段共聚物模聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷(P123)与制革用植物鞣剂BA栲胶混合，其中P123是合成介孔结构的常用模板剂，同时还可以有效的维持孔结构的有序性；BA栲胶具有类似于表面活性剂的胶束结构，一方面可以作为大孔结构的“造孔剂”，另一方面BA栲胶分子中存在的酚羟基、磺酸基可以与金属离子络合，从而控制金属源的水解速率.所合成的多级孔ZrO2可以有效的吸附分离牛血红蛋白(BHb).

1 实验部分

1.1 实验原料

聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123,Mw～5800)，分析纯，Sigma-aldrich(上海)贸易有限公司；硫酸锆(Zr(SO4)2)，分析纯，天津市光复精细化工研究所；BA栲胶，工业级，四川德赛尔化工有限责任公司；磷酸二氢钠(NaH2PO4),分析纯，天津天力化学试剂有限公司；磷酸氢二钠(Na2HPO4)，分析纯，天津科密欧有限公司；无水乙醇，天津富宇精细化工有限公司；氯化钠、氢氧化钠、浓盐酸、分析纯，漯河市致远化工有限公司；牛血红蛋白，生物纯，北京索莱宝科技有限公司.

1.2 实验仪器

紫外可见分光光度计UV 9100，莱伯泰科有限公司；pH计PHS-3C，上海盛磁仪器有限公司；马弗炉KSL-1100X-S，中美合资合肥科晶科技有限公司；恒温振荡器(数显)SHA-C，常州国华电器有限公司；分析天平BS 224 S，北京赛多利斯仪器有限公司；低速台式离心机TDL-50B，上海安亭科学仪器厂；电热鼓风干燥箱DHG-9070A，上海一恒科学仪器有限公司.

1.3 材料制备

按照n(P123)；n(BA栲胶)；n(Zr(SO4)2)=0.01∶0.02∶0.7的原料比制备锆前驱体：称取1.0 g P123和0.775 9 g BA栲胶分别溶解于20 mL的乙醇溶液和30 mL的水溶液中，于室温条件下搅拌20 min至完全溶解，再加入4.286 4 g Zr(SO4)2，室温下搅拌3 h至Zr(SO4)2充分水解，水解结束后将混合溶液转移至培养皿中，于40 ℃烘箱中陈化2天后于60 ℃中干燥1天；最后将所得的红棕色样品在马弗炉中焙烧(250 ℃ 100 min→650 ℃ 4 h)制得具有多级孔结构的ZrO2.

1.4 吸附实验

1.4.1 单因素优化实验

以BHb作为目标蛋白探究多级孔ZrO2对蛋白质的吸附性能.首先称取0.1 g ZrO2至10 mL BHb溶液(0.5 g/L)中，在恒温振荡器中室温下震荡，分别于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h、12 h时取样、离心(5 000 rpm,5 min)，采用分光光度计法，于409 nm处测量上清液吸光度，探究ZrO2对BHb的吸附动力学曲线.在平衡吸附时间下分别探究pH和离子浓度对BHb吸附能力的影响.取一定量的ZrO2，测定其对不同初始浓度的BHb(0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L、0.6 g/L、0.7 g/L、0.8 g/L、0.9 g/L)的吸附性能得到ZrO2对BHb的吸附等温线.其吸附能力计算如公式(1)、(2)所示：

(1)

(2)

式(1)、(2)中：R,qe为吸附剂对BHb的吸附率和吸附容量mg/g，C0和C分别为BHb的初始浓度和平衡浓度(g/L),V,M分别为BHb的体积(mL)和吸附剂质量(g)

1.4.2 吸附剂零点电荷的测定

将5 mg的吸附剂加入到20 mL 0.2 M 的NaCl溶液中，利用0.1 M HCl或NaOH溶液调节初始pH(pHi，1.0～7.0).将混合液于恒温水浴震荡仪中25 ℃恒温震荡48 h后测定溶液pH(pHf)，pH对ΔpH(pHi-pHf)做曲线，曲线与横坐标的交点即为吸附剂零点电荷(pHPZC).

1.4.3 吸附动力学与热力学实验

为了研究ZrO2对BHb的吸附机理，使用拟一级线性速率方程和拟二级线性速率方程进一步分析和拟合动力学曲线，按照公式(3)、(4)进行计算：

ln(Qe-qt)=lnq1-k1t

(3)

(4)

式(3)、(4)中：Qe和qt分别为平衡时的最大吸附容量和某一时刻的吸附容量(mg/g)，q1和q2分别为最大吸附容量的理论值(mg/g)k1(min-1)和k2(g/mg/ min)分别为拟一级线性速率方程和拟二级线性速率方程的速率常数.

为了进一步研究ZrO2对BHb的吸附行为，利用Langmuir和 Freundlich模型吸附等温线进行模拟和分析，并按照公式(5)、(6)进行拟合分析:

qe=bQmCe/(1+bCe)

(5)

qe=exp(k+1/nlnCe)

(6)

式(5)、(6)中：qe(mg/g)为平衡时的吸附容量，Qm(mg/g)为饱和吸附量，Ce(mg/L)为染料的初始浓度，b(L/g)为Langmuir方程常数，k和n为Freundlich常数.

2 结果与讨论

2.1 单因素优化实验结果

2.1.1 pH对MB吸附性能的影响

由于蛋白质都具有等电点的性质，研究不同pH条件下对蛋白质的吸附性能具有重要意义.因此，本研究利用PBS缓冲溶液调节蛋白质溶液的pH在4.5～9的范围，分别研究了ZrO2对不同pH条件下的蛋白质的吸附能力.如图1所示，在不同pH条件下，探究0.1 g ZrO2材料吸附10 mL BHb(0.5 mg/mL)溶液360 min时吸附性能的变化情况.当pH在4.5～6的范围内，随着pH的升高，ZrO2对BHb的吸附率逐渐增加，吸附容量也逐渐增加，当pH达到6时，ZrO2对蛋白质的吸附率达到了98.6%，吸附基本达到完全，此时的吸附量也达到了最大值41.4 mg/g.继续升高pH，ZrO2对BHb的吸附能力明显降低，其吸附率从98.6%降低至27.6%，吸附容量从41.4 mg/g降低到11.6 mg/g.

图1 pH对多级孔ZrO2吸附BHb的影响

为了进一步探究多级孔ZrO2吸附剂与BHb的作用方式，测定了多级孔ZrO2的零点电荷(pHPZC，如图2所示).从图2可以看出，ZrO2的pHPZC为3.2，因此当pH>3.2时，吸附剂材料表面带负电荷.BHb的等电点为6.7，当pH<6.7时，蛋白质表面带正电荷，与ZrO2吸附剂静电结合，当pH由6变为7时，BHb表面处于正电荷向负电荷过渡的过程，因此表现出明显的吸附能力的变化，从而证明ZrO2与BHb之间的结合主要依靠静电作用力[2].

图2 多级孔ZrO2的零点电位

2.1.2 吸附时间对BHb的吸附性能影响

图3表示在不同吸附时间的条件下，采用0.1 g的ZrO2材料对10 mL BHb (0.5 mg/mL，pH=5)溶液的吸附能力变化.从图3可以看出，随着时间的延长，ZrO2对BHb的吸附速率逐渐减慢，在480 min后吸附速率基本保持不变，达到吸附平衡状态，这一结果证明ZrO2对BHb的吸附并不是简单的表面吸附作用，而是存在内部扩散作用，因此其达到吸附平衡的时间较长[14].

图3 吸附时间对多级孔ZrO2吸附BHb的影响

2.1.3 吸附剂用量对BHb的吸附性能影响

图4表示利用不同含量ZrO2(0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.12、0.14 g)吸附剂对10 mL BHb(0.5 mg/mL，pH=6)溶液的吸附性能的影响，其中吸附时间保持在360 min.从图4可以看出，随着吸附剂用量的增加，ZrO2对BHb的吸附能力逐渐增大，这是因为吸附剂用量的增加将提供更多吸附位点，提高了与BHb作用的可能性.当吸附剂用量达到10 mg/mL时，BHb基本被吸附完全，吸附率达到了99.03%，继续增加吸附剂用量，BHb的吸附率基本不发生改变，此时的吸附容量为39.4 mg/g.

图4 ZrO2用量对多级孔ZrO2吸附BHb的影响

2.1.4 离子浓度对BHb吸附的影响

离子强度对吸附剂吸附蛋白质的影响较为复杂，因为离子强度不仅会影响蛋白质的溶解情况，还会影响吸附剂与蛋白质间的作用能力.因此向10 mL pH为6的BHb溶液中(0.5 mg/mL)加入不同量的氯化钠，采用0.1 g的ZrO2材料吸附上述蛋白质溶液360 min，探究离子强度对蛋白质吸附性能的影响.图5为不同离子浓度对ZrO2吸附BHb的影响.从图5可以看出，当离子浓度低于0.8 mol/L时，BHb在ZrO2材料上的吸附能力逐渐降低，继续增加离子浓度，ZrO2对BHb的吸附能力显著增强，当离子浓度达到1.5 mol/L时，其对BHb的吸附能力与不外加离子时相近.因此，在后续的研究中，我们均在不外加离子浓度的条件下研究ZrO2对BHb的吸附能力.

图5 离子浓度对多级孔ZrO2吸附BHb的影响

2.2 吸附机理

2.2.1 动力学吸附速率模型研究

为研究ZrO2对BHb的吸附机理，采用拟一级、拟二级吸附动力学速率方程对图3的实验数据进行拟合.图6为ZrO2对BHb吸附的动力学拟合曲线，拟合参数如表1、2所示.从图6可以看出，拟二级线性速率方程的相关性较拟一级线性速率方程更好，表1、2中也可以看出，拟二级线性速率方程拟合的相关系数R2=0.999 83，而拟一级线性速率方程拟合的相关系数为R2=0.954 07.此外，利用拟二级线性速率方程求得到的吸附容量与实际值更为接近.因此，拟二级速率线性方程能够更好地描述ZrO2对BHb的吸附行为，表明该吸附过程以化学吸附为主[15].

(a)准一级动力学拟合曲线

(b)准二级动力学拟合曲线图6 多级孔ZrO2对BHb吸附的动力学拟合曲线

表1 准一级动力学模型参数

表2 准二级动力学模型参数

2.2.2 吸附等温线研究

图7为不同BHb初始浓度下得到的ZrO2的吸附等温线.从图7可以看出，随着BHb初始浓度从0.2 g/L增加到0.5 g/L，ZrO2对BHb的吸附量迅速增加，继续增加蛋白质的浓度，ZrO2对BHb的吸附量变化基本趋向于平缓，说明ZrO2材料对BHb的吸附达到了饱和状态，吸附容量为40 mg/g.这是因为随着蛋白质浓度的增加，增大了BHb分子的含量，而吸附剂材料的活性位点数目有限，使得ZrO2的吸附能力逐渐趋于饱和[16].

图7 多级孔ZrO2对BHb吸附的吸附等温线

图8为Langmuir和Freundlich拟合曲线，拟合参数结果如表3、4所示.由图8和表3、4可知，Langmuir方程拟合相关系数R2为0.992 78，而Freundlich方程拟合相关系数R2仅为0.883 69.表明ZrO2材料对BHb的吸附过程符合Langmuir单层吸附[17].

(a)Langmuir等温线

(b)Freundlich等温线图8 多级孔ZrO2对BHb的吸附等温线

表3 Langmuir方程拟合参数

表4 Freundlich方程拟合参数

3 结论

(1)多级孔ZrO2对BHb有很好的吸附效果，在吸附时间480 min、吸附剂用量10 mg/mL、pH=6、蛋白质初始浓度0.5 g/L以及不外加离子浓度的条件下，BHb的吸附容量可达40 mg/g.

(2)多级孔ZrO2对BHb的吸附过程符合准二级速率线性方程和Langmuir模型，表明BHb在ZrO2上的吸附是以化学吸附为主的单分子层吸附.