微调控增强植物纤维对葡萄糖氧化酶的吸附性能研究

杜 飞， 杨丽红， 李志健， 于之涵

(陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 轻化工程国家级实验教学示范中心， 陕西 西安 710021)

0 引言

自纸基微流控分析技术提出以来，以滤纸为基底的纸芯片加工制造技术日益成熟.植物纤维是一种天然易于加工、改性的生物材料.可以通过物理、化学、生物等微调控方法，控制单根植物纤维细胞壁成分、疏水性、吸附性、微细纤维距离、表面活性基团等，从而达到改变成纸后纸张表面性能的目的[1-3].David M.Cate等[4]研究发现植物纤维种类影响抗体的固定和检测，棉纤维原料纸芯片可以更好的检测β-人绒毛膜促性腺激素.Cao R等[5]研究发现在纸基芯片表面加载葡聚糖可以对抗体起到很好的保护作用，在葡聚糖存在下抗体可以稳定存在120天.崔辉[6]研究聚合物与纤维的吸附性能和吸附机理，发现在纸张的抄造过程中通过打浆变化、细小纤维添加等方法可明显改善纸张对聚合物的吸附能力，并且不会对纤维成纸性能产生不利影响.

荧光标记技术[7-12]能够检测结构复杂的生物分子，具有较高的灵敏性而被广泛应用于医药、生理、环境科学等领域.宋春美[13]采用异硫氰酸荧光素作为标记材料标记莱克多巴胺单克隆抗体，并对其灵敏度、特异性等进行了测定.Nardo等[14]将羧基化量子点通过活化酯方法与伏马毒素抗体偶联作为荧光标记探针，建立了玉米中伏马毒素 B1 荧光免疫层析试纸检测方法.韩章润等[15]通过荧光物质标记糖胺聚糖观察其与硫酸软骨素的结合情况，发现荧光标记对其生物活性没有影响.

基体负载生物标记物的量是研究纸芯片稳定性的前提，吸附量提高可以间接弥补由于酶活下降带来的检测误差，从而增强纸芯片的稳定性.目前公认提高纸芯片稳定性的方法是将标记物冷冻干燥加载于纸芯片表面[16-20].将重点放在固定化材料本身表面性能和结构对生物标记物稳定性影响上的相关研究较少.本研究通过调整纤维配比、增加纤维表面羟基、添加木素、引入乙基和羧基基团等微调控的方法提高纸芯片基底对葡萄糖氧化酶的吸附量，间接起到增加纸芯片稳定性的要求.

1 实验部分

1.1 实验原料

化学浆板(针叶木浆、阔叶木浆、棉浆)：江苏UPM 公司；热磨机械浆，江苏UPM公司；定性滤纸(中速，定量80 g/m2，杭州特种纸业有限公司)；葡萄糖氧化酶(10 KU，sigma)；木质素(脱碱，上海阿拉丁生物科技有限公司)；Super Fluor 488，SE琥珀酰亚胺酯荧光试剂(南京固与生物有限公司).

1.2 实验设备

槽式打浆机 (TD8-23，咸阳通达轻工设备有限公司)；标准浆料疏解机 (992304，瑞典 L&W)；纸样抄取器 (TD10-200，咸阳通达轻工设备有限公司)；抗张强度试验仪(062/969921，瑞典 L&W)；克列姆法吸水高度仪(咸阳通达轻工设备有限公司)；场发射扫描电镜(VERIOS 460,FEI)；荧光光谱仪(FS5，英国爱丁堡)；激光共聚焦荧光显微镜(蔡司LCM800)；电热鼓风干燥箱 (DHG-9053A，上海一恒科技有限公司)；电子天平 (MC249，北京赛多利斯仪器系统有限公司).

1.3 实验方法

1.3.1 葡萄糖氧化酶溶液的配制

分别取7.9 g氯化钠，0.2 g氯化钾，0.24 g磷酸二氢钾，1.8 g磷酸氢二钾溶于800 mL去离子水中，用盐酸调节pH为6.5，定容至1 L，配制为PBS缓冲液.取10 mg的葡萄糖氧化酶溶解至1 L PBS缓冲液中，保存至4 ℃备用，此时酶活为1 U/mL.

1.3.2 微调控植物纤维

刘伟[21]通过打浆处理改善植物纤维表面接枝率，增加了纤维表面粗糙率，提高改性纤维对六价铬的吸附能力.研究表明，纤维表面的粗糙度提高，生物标记物与纤维的接触面积增大，有利于提高纤维对酶的吸附能力；朱媛媛[22]将木质素作为吸附材料用于吸附废水中金属离子、染料等物质.李英[23]利用超声波技术合成CMC吸附染料，如亚甲基蓝和Pb2+、Cu2+等金属离子，来吸附水中的污垢.

本研究采用增加纤维表面粗糙度、添加木素、引入羟基和羧基基团等微调控的方法对纤维表面进行改性.

(1)微调控法提高纤维表面粗糙度

为增加纤维的表面粗糙度，提高酶与纤维的吸附量，将阔叶木、针叶木、棉浆、桦木、HYP A(杨木)等五种植物纤维分别进行疏解打浆，打浆度分别为15 °SR、20 °SR、30 °SR、40 °SR、50 °SR，将其密封入浆袋中平衡水分，备用.

(2)微调控添加木素

木素结构复杂，含有较多的甲氧基、羟基和羰基,这些功能基可作为标记物的吸附位点，具有较强的化学反应能力，越来越多的研究结果表明各种木质素及其改性产物表现出良好的吸附性能.不仅可用于吸附金属离子等，还可用来吸附酚类、醇类、碳氢化合物、卤化物和其他物质如染料、杀虫剂、蛋白质、酶等.本研究取先前不同种类不同打浆度的植物纤维进行抄片，纸张定量为80 g/m2，将木素加热溶解后，在纸页成型过程中加入纸张内，木素的质量相对于绝干浆的1%.

(3)微调控引入羟基

Helka Juvonen等[24]、齐在前等[25]通过滤纸表面接枝、引入羟基等基团的方法增加材料对蛋白质的吸附能力.上述研究表明，羟基等基团有助于提高生物标记物的亲和能力.本研究取不同种类初始打浆度的植物纤维进行抄片，纸张定量为80 g/m2，将羟乙基纤维素溶解后，在纸页成型过程中加入纸张内，羟乙基纤维素的质量相对于绝干浆的1%.

(4)微调控引入羧基

羧甲基纤维素是纤维素衍生物，存在一定数量的羧基和未被取代的羟基，易溶且保形力强，广泛用作吸附剂、稳定剂等.取不同种类初始打浆度的植物纤维进行抄片，纸张定量为80 g/m2，将羧甲基纤维素溶解后，在纸页成型过程中加入纸张内，羧甲基纤维素的质量相对于绝干浆的1%.

1.3.3 荧光标记葡萄糖氧化酶

标记：将Super Fluor 488,SE放入干燥器中慢慢恢复至室温后，加入无水DMSO将其溶解至浓度为1 mg/mL.将1 mg葡萄糖氧化酶加入荧光标记物溶液中，在暗处常温搅拌1 h使其充分溶解接触，置于-20 ℃下避光保存.

透析：将透析袋裁剪至10 cm左右，置于2%碳酸氢钠，1 mmol/L，pH为8的混合溶液中，煮沸10 min后捞出，用去离子水将其漂洗3～4次，备用.用移液枪取50μL荧光标记后葡萄糖氧化酶，置于透析袋内，加25 mL去离子水将其稀释500倍，用夹子将透析袋封口，置于200 mL 0.15 mol/L氯化钠溶液中常温避光透析4次，每次4 h，在4 ℃下再次避光透析过夜，以除去未标记上的染料.

1.3.4 植物纤维固定化葡萄糖氧化酶

用微调控处理后的植物纤维进行抄纸，纸张定量为80 g/m2.实验室纸页成型器的面积为0.031 7 m2，抄片的绝干浆质量为2.53 g.将不同微调控植物纤维所得的抄片裁剪为3 cm×3 cm的小纸片，每一抄片分别取两个样品，得到两组样品.取其中一组样品，浸于葡萄糖氧化酶与PBS缓冲液30 s后取出，将其重新裁剪为1 cm×1 cm的小纸片，放置于4 ℃下保存，进行场发射扫描电镜检测.取另一组样品将其浸于透析后的荧光标记葡萄糖氧化酶溶液中，浸泡30 s后取出，放置4 ℃下保存，进行激光共聚焦荧光显微镜和荧光光谱仪检测.

1.3.5 微调控后纸基物理性能检测

(1)抗张强度的影响

以定性滤纸为对照组，将定量为80 g/m2的纸基样品裁剪至长为150 mm，宽为15 mm的纸条，不同植物纤维原料在不同打浆度下的纸基分别取10个样品，备用.抗张强度S[26]通过公式(1)计算.

S=F/LW

(1)

式(1)中：S为纸张的抗张强度，N/m；F为平均抗张力，N；LW为纸张宽度，mm.

(2)纸基吸水能力的影响

以定性滤纸为对照组，将定量为80 g/m2的纸基样品裁剪至长为200 mm，宽为15 mm的纸条，不同纤维原料在不同打浆度下所得纸基分别取3个样品，备用.将纸条统一伸入克列姆吸水测定仪液下5 mm处，定时10 min后，记录所得水印高度.

2 结果与讨论

2.1 酶对纤维表面的选择性吸附研究

图1为不同种类纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图像.由图1可知，葡萄糖氧化酶均分布在纤维表面，附着在单根纤维上，为微调控增强植物纤维对酶的吸附性能提供依据，进一步证明在纤维表面进行的微调控对酶吸附起决定性作用.

(a)针叶木 (b)阔叶木

(c)针+阔,质量比为1∶1 (d)热磨机械浆

(e)热磨机械浆 (f)对照组滤纸图1 不同种类纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图像(×3 500)

2.1.1 纸基表面葡萄糖氧化酶吸附量与荧光强度的关系

为验证植物纤维吸附葡萄糖氧化酶的量与荧光强度之间的关系，利用荧光光谱仪对其结果进行表征，取实验1.3.3中所配置1 mg/mL荧光标记后葡萄糖氧化酶进行实验.将标记后酶溶液分别进行不同倍数稀释，将其稀释至50倍、100倍、150倍、200倍、250倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍后，取50μL加载于3 cm×3 cm面积的小纸片上，小纸片以阔叶木浆为例，以定性滤纸作为对照组，每个样品测量10次，取其平均值后，所得结果如图2所示.

(a)阔叶木荧光强度

(b)定性滤纸荧光强度

(c)荧光强度与荧光标记酶稀释倍数的关系图2 纸基表面葡萄糖氧化酶吸附量与荧光强度的关系

由图2可知，阔叶木与定性滤纸的荧光强度均与荧光标记酶的浓度有关，且大致呈比例关系，随着荧光标记酶溶液的稀释倍数增大，植物纤维吸附酶后的荧光强度减小.即荧光标记酶的浓度越大，纸基材料吸附酶后的荧光强度越大，即荧光强度可作为判断植物纤维对葡萄糖氧化酶吸附性能研究的重要依据.

2.1.2 微调控对不同纤维吸附酶的影响

以定性滤纸为例，微调控后的不同种类纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM结果如图3～7所示.由图可知，葡萄糖氧化酶均负载于纤维表面.图3～7中的(c)图表示纤维从原始打浆度15 °SR提高到50 °SR时，纤维表面的粗糙度增加，并增大了酶与纤维的吸附面积，因此纤维对酶的吸附量明显增加.图3～7中的(d)、(e)、(f)图分别表示在原始纤维基础上添加木素、引入羧基、羟基基团后，纤维对酶的吸附量明显多于图3～7中(b)图所示原始纤维对酶的吸附量.

(a)定性滤纸 (b)15 °SR阔叶木 (c)50 °SR阔叶木

(d)阔+木素 (e)阔+CMC (f)阔+HEC图3 微调控后阔叶木纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图

(a)定性滤纸 (b)15 °SR针叶木 (c)50 °SR针叶木

(d)针+木素 (e)针+CMC (f)针+HEC图4 微调控后针叶木纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图

(a)定性滤纸 (b)15 °SR混合纤维 (c)50 °SR混合纤维

(d)混合+木素 (e)混合+CMC (f)混合+HEC图5 微调控后混合纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图

(d)棉+木素 (e)棉+CMC (f)棉+HEC图6 微调控后棉纤维吸附葡萄糖氧化酶的SEM图

(a)定性滤纸 (b)TMP 15 °SR (c)TMP 50 °SR

(d)TMP+木素 (e)TMP+CMC (f)TMP+HEC图7 微调控后TMP吸附葡萄糖氧化酶的SEM图

为进一步验证SEM结果，用1.3.3所述方式，使用荧光标记物Super Fluor 488，SE对葡萄糖氧化酶进行标记，并采用激光共聚焦荧光显微镜进行表征，所得结果如图8～12所示.

激光共聚焦荧光显微镜结果显示，图8～12展示了×63油镜下，定性滤纸与微调控前后不同纤维种类对葡萄糖氧化酶的吸附情况，结果显示微调控后纤维荧光亮度较强；相比较而言，定性滤纸以及未进行微调控的阔叶木纤维吸附葡萄糖氧化酶数量较少，荧光亮度较弱.进一步验证了SEM表征结果.

(a)定性滤纸 (b)15 °SR阔叶木 (c)50 °SR阔叶木

(d)阔+木素 (e)阔+CMC (f)阔+HEC图8 阔叶木纤维吸附荧光标记酶的激光共聚焦荧光显微镜图像

(d)针+木素 (e)针+CMC (f)针+HEC图9 针叶木纤维吸附荧光标记酶的激光共聚焦荧光显微镜图像

(a)定性滤纸 (b)15 °SR混合 (c)50 °SR混合纤维

(d)Mix+木素 (e)Mix+CMC (f)Mix+HEC图10 混合纤维吸附荧光标记酶的激光共聚焦荧光显微镜图像

(a)定性滤纸 (b)15 °SR棉纤维 (c)50 °SR棉纤维

(d)棉+木素 (e)棉+CMC (f)棉+HEC图11 棉纤维吸附荧光标记酶的激光共聚焦荧光显微镜图像

(a)定性滤纸 (b)TMP15 °SR (c)TMP 50°SR

(d)TMP+木素 (e)TMP+CMC (f)TMP+HEC图12 TMP吸附荧光标记酶的激光共聚焦荧光显微镜图像

用1.3.3所述方式制样，使用荧光标记物Super Fluor 488，SE对葡萄糖氧化酶进行标记，采用荧光光谱仪对微调控后载酶纤维进行表征，所得结果如图13～17所示.

图13～17荧光光谱仪结果显示，微调控后不同纤维固定葡萄糖氧化酶的荧光强度均高于未进行微调控纤维与定性滤纸.即经微调控方法处理后的多种植物纤维对酶的吸收量均增加，且增加量为95%～220%，微调控手段有效且具有广谱性.

图13 荧光标记酶在阔叶木纤维上的荧光强度

图14 荧光标记酶在针叶木纤维上的荧光强度

图15 荧光标记酶在混合纤维上的荧光强度

图16 荧光标记酶在棉纤维上的荧光强度

图17 荧光标记酶在TMP上的荧光强度

2.2 微调控对植物纤维的物理性能影响

2.2.1 微调控对纤维抗张强度的影响

植物纤维由于其纤维自身的差异具有不同的抗张强度，通过微调控后经相同抄片条件下所得的纸基以1.3.5(1)所述方式制样后，抗张强度结果如图18所示，所得结果为10个样品测试后的平均值.

图18结果显示，随着打浆度的提高，植物纤维纸基的抗张强度迅速增强，在相同抄片条件下，在纤维内添加木素、引入羟基羧基基团等微调控手段对植物纤维的抗张强度没有负面影响，且微调控后纸芯片纸基的抗张强度增加量为4.9%～39%，其中提高打浆度时抗张强度增加量为520%～740%.

图18 微调控前后各纤维的抗张强度

2.2.2 微调控对纤维毛细吸收性能的影响

以1.3.5(2)所述方式制样，利用克列姆法对纸基的吸水性能检测，以滤纸为对照组，以微调控处理后阔叶木纸基、TMP纸基为例进行纤维毛细吸水能力测试，结果如图19所示，所得结果为每组样品测量3次的平均值.

图19、图20结果显示，以定性滤纸为对照组，微调控后纸基纤维的毛细吸水性能随着打浆度的增加呈稍下降趋势，纤维的毛细吸水高度随打浆度升高而降低；通过加入木素，或引入羟基羧基等亲水性基团时，纤维的毛细吸水性能略微增强，微调控后毛细吸水高度增加量为0.1%～13.9%.

(a)阔叶木纸基 (b)TMP纸基图19 微调控前后各纤维的毛细吸水能力(图片中从左至右依次为滤纸、原始纤维、50 °SR纤维、原始纤维+木素、原始纤维+HEC、原始纤维+CMC)

图20 微调控前后各纤维的毛细吸水高度

3 结论

本研究通过对植物纤维进行打浆提高表面活性羟基，配比，添加木素，添加CMC、HEC引入羧基、羟基等基团的微调控手段，提高植物纤维对葡萄糖氧化酶的吸附量，提高纸芯片的稳定性，以定性滤纸作为对照组，重点探究了微调控前后植物纤维对葡萄糖氧化酶的吸附量以及微调控对纸芯片核心物理性能的影响.

(1)SEM与激光共聚焦荧光显微镜结果均显示，以滤纸为对照组时，微调控后的不同浆种对酶的吸附量均增加，通过提高纤维表面粗糙度，增加酶与纤维的吸附面积，引入羟基、羧基等基团均可增强不同种类植物纤维对葡萄糖氧化酶的吸附，即微调控手段对增强纸芯片稳定性有效且具有广谱性.

(2)纸芯片的核心物理性能包括抗张强度和毛细吸水能力，对微调控后纸芯片纸基核心物理性能进行测定，结果表明微调控后纸芯片纸基的抗张强度增加量为4.9%～39%，其中提高打浆度时抗张强度增加量为520%～740%，微调控后纸芯片纸基的毛细吸水高度增加量为0.1%～13.9%.即微调控方法可有效提高纸芯片纸基对酶的吸附性能，且未改变纸芯片的亲水性质或纸芯片的强度性能造成明显影响.