酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率的工艺优化

郭 欣，郭 萌

(1. 漳州职业技术学院食品工程学院,福建漳州 363000;2. 农产品深加工及安全福建省高校应用技术工程中心,福建漳州 363000)

黑木耳(Auriculariaauricular)又称木耳，富含多种营养成分及生理功能物质[1]，具有较高的食用和药用价值。其中，存在于细胞中的黑木耳多糖是黑木耳生物活性的主要成分，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂和增强免疫等功效[2-4]。近年来，黑木耳功能性保健食品开发研究逐渐增多，例如黑木耳发酵饮料、黑木耳面包、黑木耳果冻、黑木耳低脂灌肠制品等[5-6],但这些产品大多未对黑木耳进行深加工，仅是将其作为原料直接添加入食品中，黑木耳多糖溶出率不高，造成了原料的浪费。目前，国内外对于提高多糖提取率的方法研究主要集中在热水浸提法[7]、酸碱浸提法[8-9]及酶、微波、超声等辅助提取法[10-12]。这些提取方法存在耗时长、工艺复杂、加入化学溶剂、破坏其它营养成分等不足，不适合后续食品加工。

本文采用酵母发酵法，利用酵母菌内在酶系，促使黑木耳细胞壁纤维之间的酯键断裂而发生剥皮反应[13-14]，使更多易被人体吸收的黑木耳多糖游离释放出来。此方法成本低、易操作，黑木耳多糖溶出率高，并且原有营养成分基本保持不变，是一种相对有效，更加适合保健食品深加工的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

黑木耳：福建省龙海市安利达工贸有限公司；酵母：湖北安琪酵母有限公司。

1.2 设备与仪器

数显恒温水浴锅(JHH-4)：江苏荣华仪器有限公司；紫外可见分光光度计(UV5800PC)：北京普析通用仪器有限公司；pH计：上海精密仪器仪表有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵工艺流程

发酵工艺流程如图1所示。

图1发酵工艺流程图
Fig1Fermentation process flow cohart

1.3.2 黑木耳多糖提取及测定

参照王伟等[15]的提取方法。发酵液离心过滤取上清液，用旋转蒸发仪浓缩。随后缓慢加入3倍体积的无水乙醇，低温静置过夜可见沉淀，即为黑木耳粗多糖。多糖含量测定方法参照苯酚-硫酸法测定[16]。多糖提取率(%)=多糖质量(g)/干木耳质量(g)×100 %

1.3.3 酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率单因素试验

(1)不同酵母添加量对黑木耳多糖溶出率的影响

在发酵温度30 ℃，发酵时间16 h，pH 6.5的条件下，选取酵母添加量为 0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 g/L等5个水平，研究不同酵母添加量对黑木耳多糖溶出率的影响。

(2)不同发酵温度对黑木耳多糖溶出率影响

在酵母添加量0.75 g/L，发酵时间16 h，pH6.5的条件下，选取发酵温度为18、22、26、30、34、38 ℃等6个水平，研究不同发酵温度对黑木耳多糖溶出率的影响。

(3)不同发酵时间对黑木耳多糖溶出率影响

在酵母添加量0.75 g/L，发酵温度30 ℃，pH6.5的条件下，选取发酵时间为8、16、24、32、40 h等5个水平，研究不同发酵时间对黑木耳多糖溶出率的影响。

(4)不同pH对黑木耳多糖溶出率的影响

在酵母添加量0.75 g/L，发酵温度30 ℃，发酵时间16 h的条件下，选取pH为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5等5个水平，研究不同pH对黑木耳多糖溶出率的影响。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验基础上，采用Design Expert 8.0.6.1软件进行试验设计，以酵母添加量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)和pH值(D)作为自变量，以黑木耳多糖溶出率为指标，优化酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率的工艺条件。因素及水平如表1所示。

表1响应面设计因素及水平
Table1Factors and levels of responsesurface design

水平因素A:酵母添加量/(g·L-1)B:发酵温度/℃C:发酵时间/hD:pH-10.52685.500.7530166.51134247.5

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 不同酵母添加量对黑木耳多糖溶出率的影响

由图2可以看出，黑木耳多糖溶出率随着酵母添加量的增加先呈现上升趋势，发酵进程缩短；当酵母添加量达到0.75 g/L时，黑木耳多糖溶出率最高；之后随酵母添加量继续增大，溶出率反而下降，这可能是因为在固定的营养环境中，过多的酵母数量使得酵母之间出现互相争夺营养的现象，从而影响酵母的活性。因此，最佳酵母添加量选择为0.75 g/L。

图2 不同酵母添加量对黑木耳多糖 溶出率的影响Fig 2 Effects of different yeast addition on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.2 不同发酵温度对黑木耳多糖溶出率影响

由图3可见，随着发酵温度的增加，黑木耳多糖溶出率呈现先上升后下降的趋势，在30 ℃时出现峰值。因为酵母的最适生长温度为30 ℃，在此温度下，酵母生长最旺盛，体内酶系活性大大增加，催化黑木耳细胞壁纤维不断裂解，使多糖更容易游离出来[17-18]。而低温和高温都不利于酵母的生长，因此，最佳发酵温度选择为30 ℃。

图3 不同发酵温度对黑木耳多糖溶出率的影响Fig 3 Effects of different fermntation temperature on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.3 不同发酵时间对黑木耳多糖溶出率影响

由图4可见，发酵初期，黑木耳多糖溶出率有所增加，在发酵16 h时达到最高值17.52%。随着发酵时间的延长，黑木耳多糖溶出率不断下降，这可能是因为过长的发酵时间改变了溶出的多糖结构[19]，同时酵母发酵产生的CO2导致发酵液酸度降低，从而抑制酵母菌活性。因此，最佳发酵时间选择为16 h。

图4 不同发酵时间对黑木耳多糖溶出率的影响Fig 4 Effects of different fermntation time on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.1.4 不同pH对黑木耳多糖溶出率的影响

由图5可知，发酵液pH在4.5～6.5时，黑木耳多糖溶出率逐渐上升，说明弱酸性条件有利于黑木耳多糖的溶出。当pH超过6.5时，黑木耳多糖溶出率出现快速下降的现象，说明碱性环境时会破坏黑木耳多糖的结构使其降解，进而影响黑木耳多糖的溶出率。因此，最佳pH选择为6.5。

图5 不同pH对黑木耳多糖溶出率的影响Fig 5 Effects of different pH on dissolution rate of polysaccharide from Auricularia auricular

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验结果

在上述单因素试验基础上，以酵母添加量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)和pH(D)作为自变量，进行四因素三水平的响应面试验设计，试验结果如表2所示。利用Design Expert 8.0.6.1软件进行回归分析。

表2响应面试验结果
Table2The results of response surface experiments

序号ABCD溶出率/%10000 17.6621001 16.89 300-11 14.6240000 17.1650-101 14.7560101 16.577-1100 14.88810-10 15.239-10-10 13.46 101100 15.9611-100-1 13.5712-1-100 13.8613-1010 14.88141010 16.5715-1001 16.39160000 17.2517010-1 14.571800-1-1 11.67190000 16.9820001-1 15.8821100-1 15.49220110 16.052301-10 14.08241-100 16.72250011 16.37260-1-10 12.24270-10-1 13.52280-110 14.3290000 17.06

对表2中的试验数据进行多元回归模拟分析，得到以黑木耳多糖溶出率(Y)为响应值的回归方程：Y=17.194+0.818 3A+0.56B+1.062 5C+0.907 5D-0.445AB-0.02AC-0.355AD-0.022 5BC+0.192 5BD-0.615CD-0.547 8A2-1.347 8B2-1.616 5C2-0.999D2。

表3方差分析表
Table3The variance analysis

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性Model64.366 144.59718.37<0.000 1∗∗A3.763 13.763 215.0430.017∗B9.882 19.88239.502<0.000 1∗∗C13.54 113.5454.15<0.000 1∗∗D8.036 18.03632.12<0.000 1∗∗AB0.792 1 10.792 13.1660.096 9AC1.600×10-3 11.600×10-36.396×10-30.937 4AD0.504 1 10.504 12.0150.177 6BC2.025×10-3 12.025×10-38.095×10-30.929 6BD0.148 22 10.148 20.5920.454 2CD1.512 9 11.512 96.0470.027 5∗A21.947 11.946 77.7820.014 5∗B211.783 111.78347.106<0.000 1∗∗C216.951 116.95167.76<0.000 1∗∗D26.474 16.47425.880.000 2∗∗残差3.502 140.250 1失拟项3.327 100.332 77.636 0140.052 5净误差0.174 40.043 5总和67.86 28

注：**为差异极显著(P<0.01);*为差异显著(P<0.05)

2.2.2 响应曲面分析

由表3显著性分析可知，酵母添加量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)和pH(D)4个因素之间不是简单线性关系，而是相互交叉作用。依据上述回归方程，绘制4个因素交互作用下的响应面图及等高线图，如图6所示。

图6 各因素交互作用对黑木耳多糖溶出率的响应面和等高图Fig 6 Response surface and contour map of the interaction of various factors on the dissolution rate of Auricularia auricular polysaccharide

由图6a可知，沿着B因素(发酵温度)移动的等高线密度高于A因素(酵母添加量)方向。从曲面3D图也可以看出，沿着B因素方向的曲面更陡峭。这说明发酵温度对黑木耳多糖溶出率的影响大于酵母添加量。由图6b可知，沿着C因素(发酵时间)移动的等高线密度高于A因素(酵母添加量)方向。从曲面3D图也可以看出，C因素方向响应面曲线有一定的坡度。这说明发酵时间对黑木耳多糖溶出率的影响大于酵母添加量。同理，D因素(pH)对溶出率的影响大于A因素(酵母添加量)，C因素(发酵时间)对溶出率的影响大于B因素(发酵温度)。综合以上分析可知，4个因素对黑木耳多糖溶出率的影响主次顺序为：发酵时间>发酵温度>pH>酵母添加量，与表3方差分析结果一致。

2.2.3 最优条件及验证试验

通过Design Expert 8.0.6.1数据分析，酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率的最佳工艺条件为酵母添加量0.753 g/L、发酵温度30.72 ℃、发酵时间16.8 h、pH6.58，此条件下黑木耳多糖溶出率预测值为17.74%。考虑到实际加工条件的便利性，最终将最佳工艺选择为酵母添加量0.75 g/L、发酵温度30 ℃、发酵时间16 h、pH6.5。用该工艺条件进行3次重复试验，得到黑木耳多糖溶出率平均值为17.65%，与预测值接近，充分验证了该回归模型的准确性和可靠性，可用于酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率工艺优化。

2.3 对比研究酵母发酵法与其它提取方法对黑木耳多糖溶出率的影响

为探讨酵母发酵法的优越性，将其与其它学者研究的不同提取方法进行比较。陆雯等[20]采用热水浸提法，在提取温度60 ℃、料液比为1∶40、提取时间为2.5 h的最佳提取条件下测得黑木耳多糖提取率为5.12%。陈祖琴等[21]通过超声波提取法提取木耳多糖，通过对粒径、超声波功率、时间及料液比4个因素进行正交试验, 测得黑木耳多糖提取率为11.95%。本试验中，酵母发酵法测得黑木耳多糖提取率可达17.65%，明显高于热水浸提法和超声波提取法，大大提高了原料的利用率，有利于降低食品企业的生产成本。

3 结论

本试验采用对黑木耳浆进行酵母发酵的方法，在原有营养成分基本保持不变的情况下，提高黑木耳多糖溶出率。利用Design Expert 8.0.6.1软件对该工艺中的各个影响因素进行响应面优化，建立多元回归模拟方程。通过方差及响应曲面分析得到影响黑木耳多糖溶出率的因素主次顺序为：发酵时间>发酵温度>pH>酵母添加量。通过响应面法优化提取条件，得到最佳工艺条件为酵母添加量0.75 g/L、发酵温度30 ℃、发酵时间16 h、pH6.5。在此条件下，黑木耳多糖溶出率为17.65%，与预测值(17.74%)接近，说明该回归模型的准确性和可靠性，可用于酵母发酵法提高黑木耳多糖溶出率工艺优化。