当归HPLC 指纹图谱建立及化学计量学评价

汪英俊严 辉∗黄胜良汪国强杨美权彭国平

（1.南京中医药大学，江苏 南京 210013；2.江苏融昱药业有限公司，江苏 淮安 223001；3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023；4.云南省农业科学院药用植物研究所，云南 昆明 650223）

当归药材来源于伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels.的干燥根。始载于《神农本草经》，列为中品，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效［1］，是中医临床常用的补血药和妇科要药，素有“十方九归”之称，主产于甘肃、青海、云南、四川等省，以甘肃岷县所产为道地，称“岷当归”。当归中主要含有挥发油、有机酸、多糖等化学成分，现代药理研究发现，当归及其主要化学成分具有广泛的生物活性，对造血、循环、神经系统等均有药理作用［2-3］。近年来，我国中药工业增长迅速，对中药资源可持续供应产生了巨大的压力。2017 年，当归为我国中药材十大出口品种之一，出口量在2 723.98 吨，出口额2 539.53 万美元，出口金额占比为2.23%［4］。目前中药材人工栽培是解决供需矛盾的主要手段，而基于化学农业的中药种植模式正使中药材安全和质量面临前所未有的挑战，与此同时，中药材种植区域的不断扩大和盲目引种，也造成中药材质量问题日益突出［5］。

由于中药药效物质基础具有多组分、多靶点的特点，导致中药质量标准的研究较为复杂［6］。当前中药质量控制的方法有色谱法、一测多评法、近红外光谱技术、多元统计分析法、DNA 条形码分子鉴定法等，部分技术方法还处于发展阶段，尚未大规模推广应用，而HPLC 法在中药质量控制中已被广泛使用，具有操作简单、快速、高效、高灵敏度的特点［7］。其基于整体性和模糊性特点的中药指纹图谱技术是符合中药特点的质量控制模式之一，化学计量学的引入进而将中药复杂的多成分鉴别转化为对数据的解析，达到定性与定量研究的目的［8］。有关指纹图谱结合化学计量学的当归质量研究已有报道［9-10］，本研究在建立当归HPLC 指纹图谱的基础上，通过对照品比对、相似度评价、主成分分析和聚类分析等识别技术对样品进行研究，同时对其近缘种加以区分，以期为当归的质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器 Waters 2695 Alliance 高效液相色谱系统（美国Waters 公司，含四元泵溶剂系统、在线脱气机、自动进样器、PDA 检测器，Empower 3 工作站）；赛多利斯BSA323SCW 型电子天平（德国赛多利斯科学仪器有限公司）；EPED 超纯水系统（南京易普达易科技发展有限公司）；KH5200B 型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；D2012 高速台式离心机（大龙兴创实验仪器北京有限公司）；1000 型睿核高速多功能粉碎机（永康市天祺盛世工贸有限公司）。

1.2 试剂 对照品绿原酸（批号lw18022809）、阿魏酸（批号lw18042309）、Z-藁本内酯（批号lw18010501）、正丁基苯酞（批号lw18012301）、洋川芎内酯Ⅰ（批号lw18041806）、洋川芎内酯H（批号lw18042506）、阿魏酸松柏酯（批号 lw180315016）、丁烯基苯酞（批 号lw18014801）、洋川芎内酯A（批号lw17111714）均购自南京良纬生物科技有限公司，纯度均大于98%。乙腈为色谱纯（美国Tedia 公司）；超纯水（Milli-Q 超纯水系统制备）；无水甲酸（上海麦克林生化试剂有限公司）；冰醋酸等试剂为分析纯。

1.3 样品 当归药材来源全国不同产区，信息见表1。当归近缘种药材信息见表2，朝鲜当归样品由长春中医药大学张辉教授赠与，辽藁本样品由辽宁省农科院经作所孙文松研究员赠与，上述样品均经南京中医药大学严辉副教授鉴定为正品，标本保存于南京中医药大学中药标本馆。

表1 当归样品信息

表2 当归近缘种样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetryshield C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5%的醋酸水（B），梯度洗脱（0～25 min，5%～45% A；25～35 min，45%～55% A；35～45 min，55% A；45～55 min，55%～95% A；55～60 min，95% A）；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长254 nm；进样量10 μL。

2.2 对照品溶液制备 称取适量绿原酸、阿魏酸、洋川芎内酯Ⅰ、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯A、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、丁烯基苯酞对照品，精密称定，加乙腈制成质量浓度分别为0.15、0.23、0.19、0.12、0.32、0.73、0.28、1.25、0.45 mg/mL 的对照品贮备液。分别精密吸取贮备液1 mL 置于10 mL 量瓶中，加乙腈稀释定容，摇匀。

2.3 供试品溶液制备 取当归药材粉末（过3 号筛）约0.5 g，精密称定，置50 mL 具塞锥形瓶中，精密加入3%甲酸甲醇25 mL，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，取出，放冷，补足减失质量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液（编号S1）10 μL，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6 次，记录色谱图。以Z-藁本内酯为参照峰，得各共有峰相对保留时间RSD 为0.08%～0.45%，各共有峰相对峰面积RSD 为0.06%～0.73%。表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验 精密称取同一当归样品5 份（编号S1），按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，以Z-藁本内酯为参照峰，得各共有峰相对保留时间RSD 为0.07%～0.15%，各共有峰相对峰面积RSD 为0.05%～1.79%。表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一份供试品溶液（编号S1），在“2.1”项色谱条件下，分别于0、4、8、12、16、24 h 进样10 μL，记录色谱图。以Z-藁本内酯为参照峰，得各共有峰相对保留时间RSD 为0.05%～0.15%，各共有峰相对峰面积RSD 为0.35%～1.25%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 指纹图谱建立

2.5.1 指纹图谱建立 精密称定35 批不同产地的当归样品，每份约0.5 g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，得色谱图。将其导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）进行分析，以样品S1 的色谱图为参照，以中位数法生成对照图谱，时间窗宽度为0.1 min，经多点校正、自动匹配后生成指纹图谱的共有模式见图1。

图1 35 批样品HPLC 指纹图谱

2.5.2 共有模式建立及色谱峰定位 根据35 批当归样品指纹图谱的检测结果，利用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）进行数据匹配，生成对照图谱。在对照图谱上标定24 个共有峰。通过与对照品色谱图中保留时间比对，指认8 个共有峰，其中3 号峰为绿原酸、6 号峰为阿魏酸峰、7 号峰为洋川芎内酯Ⅰ峰、8 号峰为洋川芎内酯H峰、13 号峰为阿魏酸松柏酯峰、14 号峰为正丁基苯酞峰、17 号峰为Z-藁本内酯峰、18 号峰丁烯基苯酞峰，其中以峰面积大且分离度较好的17 号峰为参照峰（S），得各共有峰相对保留时间RSD 为0.20%～0.64%，相对峰面积RSD为23.3%～64.5%，表明不同产地不同批次样品含有量存在差异，见图2。

2.5.3 相似度评价 采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版），对35 批样品指纹图谱数据进行分析，计算得35 批样品和对照指纹图谱之间的相似度，结果见表3，35 批样品相似度为0.824～0.989，表明当归的化学成分组成较为相似，各批次当归中化学成分含有量存在一定差异，S23 和S24 号样品相似度较低，可能与药材产地、生长年限、栽培及采收加工贮藏等因素有关，需进一步分析。

2.5.4 近缘种指纹图谱 在“2.1”项色谱条件下，得11批当归近缘属药材样品HPLC 图谱，将当归药材样品HPLC对照指纹图谱和11 批近缘属药材样品HPLC 图谱导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版），结果见图3。得到7 批近缘属药材样品相似度，其中白芷（0.160）、朝鲜当归（0.253）、川芎（0.772）、独活（0.203）、辽藁本（0.759）、欧当归（0.706）、野生当归（0.852）、防风（0.046）、前胡（0.039）、日本当归（0.115）。

图2 各成分HPLC 色谱图

表3 35 批样品相似度

当归在我国使用历史悠久，易混品、伪品较多，来源复杂，分布广泛，有些系同属植物，药性相近；有些系其他科属植物，药性全然不同，混用掺伪给用药安全带来极大隐患。根据相似度并结合色谱图发现白芷、朝鲜当归、独活、防风、前胡与当归整体峰形差别较大，采用HPLC指纹图谱可以从化学成分上较好地进行区别；而欧当归、川芎、藁本与当归的指纹图谱相似度较高，共有峰较多，表明他们之间的化学成分相似，结果见图4。但川芎在35～36 min 时出现一较高峰，经对照指认为洋川芎内酯A，为川芎药材特征峰，而当归中几乎不含有洋川芎内酯A，可作为二者的特征性鉴别成分。从图谱对比中可以看出，川芎和藁本中均存在特征峰，可与当归进行区别；欧当归的化学成分与我国当归相近，两者有较高的相似度，但二者在Z-藁本内酯含有量差异明显，研究表明欧当归藁本内酯的质量分数为中国当归的25.23%，并指出中、日、韩，欧洲当归原植物的来源不同，藁本内酯等活性成分有显著差异，其功效也会不同［11］，因此不宜替代、混淆用药。

图3 11 批当归近缘种药材HPLC 指纹图谱

图4 当归、川芎、藁本及欧当归图谱比较

2.6 聚类分析 将35 批样品的24 个共有峰的峰面积作为变量，导入到SPSS 22.0 软件，得到35×24 阶原始数据矩阵，采用组间联结，利用平均欧式距离法作为样品间距离计算方法进行系统聚类分析，结果见图4。聚类结果表明在聚类阈值底层，药材产地较近，随着阈值增加，产地相同或地理距离较近的样品被聚在一起，35 批样品可分为三大类，其中S23 和S24 单独聚为一类；来自云南（S11～S15）的聚为一类；甘肃与青海的聚为一类，其中来自岷县西寨镇当归标准化原料基地的药材（S1～S10）也基本聚在一起，表明不同产地的当归药材在质量上存在一定差异，当归药材具有明显的地域区分性。聚类结果与相似度分析结果一致，可用于当归药材质量一致性评价，见图5。

2.7 主成分及因子分析 运用SPSS 22.0 及Simca 13.0 软件对35 批样品24 个共有峰的峰面积数据进行主成分分析，计算主成分特征值、累积贡献率，结果抽样适合性检验系数KMO 值=0.821 ＞0.7，且巴特利特球形检验显著性P=0＜0.05，因此数据适合做因子分析。见表4。

主成分的特征值及贡献率是选择主成分的依据。以特征值大于1 为提取标准，表1 可知前5 种主成分的方差累积贡献率为85.786%，表明提取的5 种主成分可以代表原始色谱峰峰面积的大部分信息，能较好的反映当归药材指纹图谱特征。

图5 35 批样品聚类树状图

表4 主成分初始特征值和贡献率

表5 旋转后因子载荷矩阵

旋转后共有峰因子负荷矩阵，见表5。结果表明，第一主成分包含的各因子其载荷系数综合体现峰4、峰5、峰7、峰8、峰9、峰10、峰12 和峰18 对第一主成分的影响；峰6、峰13、峰14、峰15、峰16、峰17、峰19、峰20、峰23 在第二主成分中有明显正负荷值；第三主成分反映了峰21 和峰24 的信息；第四主成分反映峰4 和峰11 的信息；第五主成分反映了峰3 的信息。可见、第一主成分和第二主成分集中反映了当归药材中药效指标成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎内酯1）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本内酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析变量上权重值较大，其中峰6 为阿魏酸峰，为当归药材的法定指标性成分。以PC1 和PC2 建立坐标系进行投影，得35 批样品主成分得分矩阵图，见图6，可直观显示样品间的差异。表明，S11～S15 投影聚在一起，S23、S24 号当归药材与其他产地药材投影点相距较远，结果与聚类分析结果相一致。

图6 35 批样品主成分得分矩阵图

35 批样品的性状及特征图谱进行综合评价，发现化学成分较为一致，但各成分的含有量存在差异。由相似度及聚类分析结果可知，云南的样品聚为一大类，青海的样品与甘肃的样品聚为一大类，分析云南样品的指纹图谱共有峰峰面积时，发现6 号、13 号与17 号峰的峰面积较其他产区大，表明3 种成分在云归中含有量较高。

在主成分分析中，第一主成分和第二主成分集中反映了当归药材中的药效指标成分。其中特征峰6（阿魏酸）、7（洋川芎内酯Ⅰ）、8（洋川芎内酯H）、13（阿魏酸松柏酯）、17（Z-藁本内酯）、18（丁烯基苯酞）在主成分分析变量上权重值较大，其中峰6 为阿魏酸、峰17 为藁本内酯，为主要指标性成分，其中藁本内酯在当归含有量较高，且具有松弛平滑肌的作用，是抗胆碱和乙酰胆碱的良药。《香港中药材标准》 中收载了当归药材中藁本内酯的含有量测定项目，因此，建议当归药材质量标准中应当加入关于藁本内酯含有量的规定，以便更为全面地控制当归质量。同时本研究后期需要增加样本量及产地的代表性，进一步研究不同产区当归的质量差异。

3 讨论

3.1 指纹图谱建立 对当归药材的提取条件、方式及检测波长等进行了考察。同时对乙腈-水、乙腈-0.2%醋酸水和乙腈-0.5%醋酸水等流动相进行考察，发现乙腈-0.5%醋酸水作流动相进行梯度洗脱时各色谱峰分离度较好。实验前期曾分别比较25% 甲醇、50% 甲醇、70% 甲醇和3%甲酸甲醇4 种溶剂对阿魏酸、Z-藁本内酯、洋川芎内酯H、洋川芎内酯Ⅰ等成分提取效率的影响；比较不同提取方式（回流与超声）对色谱峰的影响，结果发现不同的提取方式对13 号峰（阿魏酸松柏酯）影响明显，加热回流提取此峰完全消失，可见阿魏酸松柏酯遇热不稳定，极易分解，与文献报道一致，阿魏酸松柏酯受热遇光极易分解成阿魏酸和松柏醇［12］。因此《中国药典》 中用回流提取的方式测定阿魏酸含有量可能不真实；对提取时间的考察，分别比较超声提取30、45、60 min 对色谱图的影响，30 min 提取效率最佳。通过条件优化，最终建立了分离度好、色谱峰较全面的当归HPLC 指纹图谱，共确认24 个共有峰，通过对照品比对，结合紫外吸收光谱特征，指认出8 个共有峰。

3.2 有效成分含有量差异 云南产当归中指标性成分阿魏酸含有量较高，阿魏酸是当归酚酸类代表性成分，也是当归的中药活性成分之一，其钠盐在心脑血管疾病方面具有广泛的效用。张金渝等［13］比较不同产地云当归中阿魏酸的含有量发现，大理鹤庆马厂产当归阿魏酸含有量最高可达1.459 mg/g；孙红梅等［14］也发现云南省沾益县当归虽然外观不具有优势，但是其指标成分含有量较高。云当归多栽培于云南西北部高寒山区，主要分布于大理、丽江、迪庆等地，低纬度高海拔及优越的气候条件成就了云归的品质，产地环境气候与药材品质的相关性还有待于进一步探讨。近年来，昆明、曲靖等地当归栽培面积增长较快，其产区生态环境、栽培方式、加工方法，以及药材外观性状、品质与传统云归均有一定区别，有待进一步评价。

中药材是中医药的源头，中药质量的提升必须对药材质量进行严格把控。近年来由于市场需求剧增及国家政策的影响，发展中药材栽培已成为很多地区脱贫致富及产业转型升级的选择，不同产地的药效物质有所差异，用药的安全性、有效性尚需深入研究。借鉴中药质量标志物研究的思维模式和方法，着眼于中药生产全过程的物质基础特有、差异、动态变化和质量的传递性、溯源性，有利于建立中药全程质量控制及质量溯源体系，以期为质控提供新的思路和方法［15］，有助于中药质量控制体系的逐步完善。