丹参提取物对铅中毒小鼠肾氧化应激的保护作用

曹春芽龚 明∗仇成凤王 安关 岚刘新民

（1.湖南医药学院，湖南 怀化 418000；2.怀化市第一人民医院，湖南 怀化 418000；3.中南大学，湖南长沙 410208；4.侗医药研究湖南省重点实验室，湖南 怀化 418000）

铅污染已成为世界当今普遍存在现象之一，随着国家工业化水平不断提高，推动经济迅猛发展的同时，也加大了铅污染的范围，增加慢性铅中毒的可能性。铅对神经细胞有强亲和力，尤其对儿童的神经系统及智力发育有严重的毒害作用［1］。世界卫生组织把铅确认为对儿童影响最严重的有毒化学物质，能影响儿童生长发育，降低免疫力。慢性铅中毒对神经系统、血液系统、心血管系统、骨骼系统等可产生终身性的伤害，铅中毒临床表现常会出现头痛、头晕、失眠，甚至烦躁、昏迷、贫血、肝肾损害等症状。目前治疗的方法可分为西医治疗与中医治疗。西医临床上主要是通过螯合铅，促进铅的排泄。其分为两类，一类是以依地酸二钠钙为代表药物的羧基螯合铅；另一类是以二巯丁二酸钠为代表药的巯基螯合铅。但是螯合剂治疗易造成人体基本元素的缺失，易引起电解质的紊乱，其不良反应限制了广泛应用。中医认为铅中毒的病机为肝失疏泄、肝胆郁滞、气化失常，可运用解毒清热、化瘀、疏肝利湿药物治疗［2］。张喜莲等［3］应用疏肝利胆法可降低血铅含有量，避免必需微量元素钙、锌的流失。中药处方多组分、多部位、多靶点、多环节的整体治疗特点，适合于症状体征复杂的慢性铅中毒的治疗，因而从天然产物中寻找预防、治疗慢性铅中毒的安全药物具有重要的意义。

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，具有活血祛瘀、通经止血、清心除烦、凉血消痈等功效［4］，是丹桃金活血方中的主要药味之一。现代药理研究表明丹参可改善微循环，对中枢神经有调节作用，可减轻铅中毒烦躁、多动症状，有利铅中毒患者神经衰弱、失眠多梦症状的调节［5］。因此，本研究探讨丹参提取物对铅中毒小鼠肾脏氧化应激保护的作用机制，以期为丹参提取物治疗慢性铅中毒提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 雄性昆明小鼠60 只，体质量20～25 g，购自南方医科大学动物中心，生产许可证号 SCXK（粤）2017-0015。

1.2 试药 丹参购自龙源大药房，经湖南医药学院王鼎老师鉴定为正品。丹参提取物本实验室自制［6］，即取丹参饮片适量，加9 倍量的60%乙醇提取1.5 h，浓缩成生药材质量浓度分别为2、4、6 g/mL。醋酸铅对照溶液（国家标准物质研究中心）；二巯基丁二酸（DMSA，美国Sigma 公司）；血清尿素氮（BUN，批号20170812）、血 清肌酐（CR，批号20170520）、丙二醛（MDA，批号20170514）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px，批号20170815）、超氧化物歧化酶（SOD，批号20170720）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；Trizol 试剂（美国Invitrogen 公司，批号15596-026），其他试剂均为分析纯。

2 方法

2.1 造模、分组 取60 只清洁级雄性昆明小鼠，随机分为正常对照组、模型组、阳性药组、丹参提取物低、中、高剂量组。适应性喂养1 周后，称定质量。除正常对照组外，每组小鼠均按体质量进行腹腔注射醋酸铅20 mg/kg，正常对照组注射相同剂量的生理盐水，每隔1 天注射1 次，自由采食、饮水，连续20 d。造模完成后对小鼠灌胃给药，正常对照组、模型组每天灌胃给予纯化水，阳性药组按体质量灌胃DMSA 混悬液70 mg/kg，丹参提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组按质量分别灌胃丹参提取物（20、40、60 g/kg），1 次/d，连续给药10 d。

2.2 样本采集与制备 给药10 d 后，禁食不禁水24 h 后，眼眶取血，处死小鼠后迅速摘取小鼠的左右肾，生理盐水洗净，吸干水分，称定质量。取左肾组织用10%福尔马林固定，用于组织病理学观察，右肾低温冷冻保存。

2.3 测定肾脏系数 处死前测定小鼠体质量，处死后迅速摘取肾脏，洗净、吸干水分、称定肾脏质量，肾脏系数=（肾脏质量/小鼠体质量）×100%。

2.4 测定血清生化指标 眼眶取血，离心，取上清液，采用全自动生化学检测仪（HTTACHI）测定小鼠BUN、CR水平。

2.5 观察肾组织病理学变化 10%福尔马林固定肾组织，酒精脱水，石蜡包埋，切片，二甲苯溶液脱蜡，HE 染色，脱水，封片，光学镜观察组织病理学变化。

2.6 测定氧化应激指标 严格按照各试剂盒的说明书测定肾脏组织中的GSH-Px、SOD 及MDA 水平。

2.7 检测Bcl-2、BaxmRNA 表达 按TRIzol 试剂盒说明书提取肾组织匀浆的总mRNA，采用qRT-PCR 检测肾脏组织中Bcl-2、BaxmRNA 表达，所用引物见表1。

表1 引物序列

2.8 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行分析。数据以（）表示，多组间采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 丹参提取物对体重及肾脏系数的影响 如表2 所示，与正常对照组比较，铅处理的小鼠的生长受到影响。与模型组比较，丹参提取物组（低、中、高剂量）与阳性药组小鼠的体质量增加（P＜0.05），其肾脏系数减小（P＜0.05）。

3.2 丹参提取物对BUN、Cr 水平的影响 如图1 所示，与对照组比较，模型组小鼠 BUN、Cr 的水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参提取物组降低小鼠BUN、Cr 水平（P＜0.05），且具有剂量依赖性。

表2 丹参提取物对小鼠体质量及肾脏系数的影响（，n＝10）

表2 丹参提取物对小鼠体质量及肾脏系数的影响（，n＝10）

注：与正常对照组比较，∗P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图1 丹参提取物对小鼠BUN、Cr 水平的影响（n＝10）

3.3 丹参提取物对组织切片病理学的影响 如图2 所示，正常对照组肾组织结构完整、无组织病理改变，模型组则有模糊的组织结构、肾小球、肾小管上皮细胞萎缩。丹参提取物组（低、中、高剂量）不同程度改善了肾组织的病理学变化，其中丹参提取物高剂量组的肾组织损伤改善程度最高。

图2 光镜下观察小鼠肾组织病理学改变（HE，× 400）

3.4 丹参提取物对SOD、GSH-Px、DMA 水平的影响 如图3 所示，与正常对照组比较，铅处理后小鼠SOD、GSHPx 水平降低，MDA 水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参提取物组SOD、GSH-Px 水平升高（P＜0.05），MDA水平降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图3 丹参提取物对SOD、GSH-Px、DMA 水平的影响（n＝10）

3.5 丹参提取物对Bax、Bcl-2 mRNA 表达的影响 如图4所示。与正常对照组比较，模型组Bcl-2 mRNA 表达降低，BaxmRNA 的表达水平升高（P＜0.05）；与模型组比较，丹参提取物组Bcl-2 mRNA 的表达增加，BaxmRNA 表达降低（P＜0.05）。

4 讨论

肾脏是对铅敏感的靶器官。铅在肾脏积累严重影响身体发育，造成一系列生理、生化指标的变化，影响中枢和外周神经系统、心血管系统、生殖系统、免疫系统的功能［7-8］。铅处理的小鼠体质量显著减轻，组织病理学变化明显，BUN、Cr 的水平显著升高，表明醋酸铅致小鼠中毒模型已成功建立。

BUN、Cr 分别为含氮有机物和蛋白代谢的终产物，作为肾小球滤过功能的诊断和过筛指标，当肾小球滤过功能减低时，血肌酐和尿素氮因潴留而增高。现代药理研究表明天然的抗氧化剂能保护铅中毒引起的肾细胞的损伤，改善肾功能［2，9］。组织病理学显示，改善肾组织结构损伤程度与丹参提取物剂量呈正比。与模型组相比，丹参提取物各组小鼠的BUN、Cr 的水平显著降低。这可能是由于丹参提取物中含有以丹酚酸为代表的大量酚酸类化合物，而大量的酚羟基结构的物质具有良好的抗氧化作用［10］，从而起到修复肾组织结构损伤作用。

图4 丹参提取物对小鼠Bcl-2 及Bax mRNA 水平的影响（n＝10）

研究表明氧化应激在铅诱导细胞损伤中扮演重要角色［11］。GSH-Px 可以保护细胞膜的结构［12］，SOD 是机体内天然存在的超氧自由基因子［13］，MDA 作为脂质过氧化的分解产物［14］，这3 个指标的水平变化反映机体内氧化程度，可作为细胞损伤的重要指标。与模型组对比，阳性药组、丹参提取物组的GSH-Px 和SOD 水平显著提高；MDA 水平显著降低。这表明丹参提取物能够消除活性氧自由基，抑制脂质过氧化，增强抗氧化防御系统，改善肾组织损伤。

Bax 和Bcl-2 作为重要的细胞蛋白来调节细胞凋亡，同时也是2 种对立的蛋白质，其之间的比值暗示了细胞发展的方向。Bax 过度表达促进细胞凋亡，而Bcl-2 的作用与其相反［15-16］。正常对照组BaxmRNA 表达显著低于模型组；与模型组对比，丹参提取物各组BaxmRNA 表达均显著性降低，Bcl-2 mRNA 表达的变化趋势与之相反。这表明丹参提取物可通过调节Bax与Bcl-2 mRNA 的表达，抑制铅诱导的细胞凋亡。

综上所述，本研究阐明丹参提取物对铅中毒小鼠肾氧化应激保护的作用机制。通过加强抗氧化防御、抑制肾细胞凋亡、改善肾组织损伤，这可能与丹参提取物中酚酸类结构物质抗氧化与抑制细胞凋亡的功能相关，这为丹参减轻铅中毒烦躁、多动症状，改善铅中毒患者神经衰弱、失眠多梦症状的调节作用提供理论依据。我国的铅污染范围广，以丹参为原料，研制出平缓排铅、副作用小的保健食品或药品，预防铅中毒，特别是防止儿童铅中毒，具有重要意义。