基于网络药理学的荆银颗粒治疗病毒性感冒作用机制研究

俞 婷刘新娟刘 力高 崎

（1.上海中医药大学，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200021；3.上海上药杏灵科技药业股份有限公司，上海 201703）

荆银颗粒是由荆芥、金银花、四季青、鱼腥草、大青叶、蒲公英、牛蒡子、防风、甘草9 味药组成，多为解表药，具有解毒、镇痛、抗炎的作用［1-5］。研究［6］表明，该处方体内外均具有良好的抗病毒作用，如RSV（RNA 病毒）、ADV3（DNA 病毒）。方中荆芥、金银花为君药；四季青、鱼腥草、大青叶为臣药；蒲公英、牛蒡子、防风为佐药；甘草为使药，调和诸药。荆芥为唇形科荆芥属植物荆芥Schizonepeta tenuifolia Briq 的干燥地上部分，又称假苏，始记于《神农本草经》 被列为中品［7］。该药物中含有多种挥发油成分及黄酮类成分，主要具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏的药理作用［8］。金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb 的干燥花蕾或初开的花。金银花一名出自《本草纲目》，其富含挥发油、黄酮和有机酸类成分［9-10］，自古具有清热解毒作用，在荆银颗粒中与荆芥同为君药，增强抗病毒作用［11-12］。

冠状病毒感染引起的肺炎是由病毒感染引起，与流感的起因及症状极其相似。荆银颗粒作为抗非典型性肺炎的处方，方中药物较多，成分复杂，而现代网络药理学适用于多成分多靶点的中药、方剂机制研究，如杜叶青等［13］应用网络药理的方法对金银花的抗炎作用机制进行预测研究；袁岸等［14］采用了网络药理学的方法，构建“成分-靶点-通路”网络，预测荆芥的抗炎作用；朱梓铭等［15］通过网络药理学的方法探究了苓桂术甘汤治疗慢性心力衰竭的作用机制。荆银颗粒具有较强的抗病毒作用，但其作用机制尚不明确，因此本研究通过网络药理学探究荆银颗粒抗病毒的主要作用机制，为今后荆银颗粒用于临床预防治疗冠状病毒感染引起的肺炎提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 荆银颗粒活性成分和成分靶点的收集 在中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和中药分子机制生物信息学分析工具BATMANTCM 数据库（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）搜索荆银颗粒9 味药的所有化学成分，以吸收、分布、代谢、排泄（ADME）参数中的口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和药物相似性（Drug-likeness，DL）≥0.18 为筛选条件，得到荆银颗粒的活性成分。同时在TCMSP 和BATMAN-TCM 中查询得到活性成分所对应靶点，并在UniProt 数据库将靶点蛋白转化为对应的基因名（Gene names）。

1.2 流感疾病靶点获取 应用 Drugbank 数据库（https：//www.drugbank.ca/ ）和 DisGeNET 数据库（https：//www.disgenet.org/），输入关键词“Influenza”查询得到流感相关靶点。将活性成分作用靶点与流感相关靶点取交集，得到荆银颗粒活性成分抗病毒的关键靶点。

1.3 “活性成分-关键靶点”网络构建与分析 活性成分与关键靶点导入Cytoscape 3.6.0 软件，构建“活性成分-关键靶点”网络，并应用Cytoscape 中“Network Analyzer”功能进行网络分析，根据Degree 值筛选荆银颗粒抗病毒的重要成分。

1.4 关键靶点蛋白相互作用（PPI）网络的构建与分析 将关键靶点导入String 数据库，限定物种为人，设定置信度≥0.9，得到的文本数据，整理后导入Cytoscape3.6.0 软件构建PPI 网络，并应用“Network Analyzer”功能进行网络拓扑指标分析，筛选Degree 值高于平均值的重要靶点。

1.5 生物功能和通路分析 应用Cytoscape 3.6.0 软件中的ClueGO 插件对关键靶点进行GO 生物功能注释和KEGG 通路分析，设置P≤0.05。

1.6 分子对接验证 Swiss Dock 在线分子对接软件，可以用来预测一个目标蛋白和一个小分子之间可能发生的分子相互作用。根据“活性成分-关键靶点”网络中重要的成分和PPI 网络中重要的靶蛋白，应用Swiss Dock 进行分子对接验证，用以评价活性成分与关键靶点之间的对接效果。

2 结果

2.1 荆银颗粒药物与疾病相关基因 从TCMSP 中获取荆银颗粒8 味药（除蒲公英）174 种活性成分，在BATMANTCM 获取蒲公英的8 种活性成分（表1），删去重复共得到荆银颗粒9 味药160 种活性成分，并且获得活性成分324个作用靶点。获得流感相关靶点621 个，通过Venn 图删去重复项得到73 个关键靶点（图1）。

表1 荆银颗粒9 味药160 种活性成分

图1 活性成分-关键靶点和流感靶点Venn 图

2.2 “活性成分-关键靶点”网络构建与分析 将9 味中药对应的160 种活性成分与73 个靶点在Cytoscape 3.6.0 软件中构建荆银颗粒抗病毒的“活性成分-关键靶点”网络图（图2）。网络中共涉及176 个节点和422 条边，其中圆形代表活性成分，菱形代表关键靶点。成分进行度值（Degree）评价，筛选重要成分共17 种，分别是槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、山柰酚、柚皮素等，Degree 值较高的成分可能是荆银颗粒抗病毒的关键成分（表2）。

2.3 PPI 网络构建与分析 将73 个关键靶蛋白导入String数据库，限定物种为人，设定置信度≥0.9，在Cytoscape软件构建PPI 网络（图3），该网络共涉及61 个节点和237条边，节点表示靶点，边表示蛋白与蛋白之间相互作用，节点大小与颜色表示Degree 值大小，Degree 值由小到大，则节点从小到大。共有27 个靶蛋白Degree 值高于平均值（表3），其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等靶点蛋白Degree 值较大，表明与其他蛋白相互作用较强，因此这些蛋白在网络中具有重要作用。

图2 活性成分-关键靶点网络图

表2 荆银颗粒抗病毒中17 种活性成分

图3 73 个关键靶点PPI 网络

2.4 生物功能和通路分析 在Cytoscape 3.6.0 软件中应用ClueGO 插件对73 个关键靶点进行GO 生物功能注释和KEGG 通路分析，设置P≤0.05，得到可视化分析饼状图（图4～5），73 个靶点主要富集在脂多糖反应（response to lipapolysaccharide）、趋向化正向调节（positive regulation of chemotaxis）、对紫外线的反应（response to UV）、单核细胞迁移调 节（regulation of mononuclear cell migration）、JAK-STAT级联反应（JAK-STAT cascade）等生物过程。

KEGG 通路图表明荆银颗粒抗病毒的最主要作用通路是白细胞介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway），同时还包括甲状腺激素合成（thyroid homone synthesis）、肌萎缩侧索硬化症［amyotrophic lateral sclerosis（ALS）］、细胞凋亡（apoptosis）、B 细胞受体信号通路（B cell receptor signaling pathway）等。

表3 Degree 值高于平均值的27 个靶蛋白

2.5 分子对接验证 选择荆银颗粒成分中含有量较高的木犀草素和靛玉红，以及指标性测定成分原儿茶醛，与PPI网络中的前2 个关键靶点RELA 和JUN，在PDB 数据库下载靶点晶体结构文件，用Pymol 软件移去水分子和配体分子。在Swiss Dock 在线软件分别上传靶蛋白和木犀草素、靛玉红以及原儿茶醛的结构文件。分子对接结果见表4，蛋白质与小分子结合越紧密，Full Fitness 值越低。结果表明3个成分与两个靶蛋白都可对接（图6～11），其中RELA 与木犀草素、JUN 与靛玉红、JUN 与原儿茶醛对接效果最好。

表4 分子对接结果

3 讨论

荆银颗粒作为治疗感冒和急性肺炎、支气管周围炎（属风热犯肺证）的常规制剂，药理研究已证明在抗病毒方面有显著的作用，因此利用网络药理学方法研究荆银颗粒抗病毒作用机制具有重要意义。

图4 关键靶点GO 生物功能注释

图5 KEGG 通路分析

图6 RELA-木犀草素分子对接

PPI 网络表明荆银颗粒多靶点抗病毒的作用特点，网络中共有73 个关键靶点，其中RELA、JUN、IL6、MAPK1、MAPK3 等27 个靶点作用较强。RELA 作用于NF-κB 信号通路。NF-κB 蛋白家族有5 个成员，在正常状态下，NF-κB没有转录活性，以三聚体的形式存在于细胞质中，NF-κB p65 是NF-κB 蛋白家族的成员之一，参与机体内炎症反应［16］。Li 等［17］研究发现，1，8-Cineol 通过减弱小鼠肺部炎症反应来增强对IFV 感染的保护，1，8-Cineol 降低了NF-κB p65、细胞间黏附分子（ICAM）-1 和血管细胞黏附分子（VCAM）-1 在肺组织中的表达，从而预防流感病毒引起的小鼠肺炎。Yang 等［18］在研究鹅掌楸碱调节肺部炎症的机制中，通过Western blot 检测NF-κB p65 的磷酸化水平和血管内皮生长因子（VEGF）的表达，得出鹅掌楸碱治疗显著抑制了肺中VEGF 的表达和NF-κB 的活化。这些研究结果均说明，NF-κB p65 参与肺炎发生过程。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信号通路上［19］。2003 年一种新型冠状病毒从非典型肺炎患者身上分离出来，被证明是现在称为严重急性呼吸系统综合症（SARS）的病原体。利用病理检测系统研究了AP-1 通路被SARS-CoV N 蛋白激活，因此SARS冠状病毒核衣壳蛋白与AP-1 信号转导通路相关，通过激活AP-1 信号转导通路来调节完整的信号传导［20］。SARS 冠状病毒的8 个附属蛋白可能参与了病毒的发病过程，其中蛋白3b 定位于细胞核，并研究了3b 对AP-1 转录活性的影响。研究阐明了在3b 转染的Huh7 细胞中AP-1 依赖性基因表达的增强，报告基因和移动性转移检测显示，在3b 存在的情况下，AP-1 转录和DNA 结合活性增加［21］。

图7 RELA-靛玉红分子对接

图8 RELA-原儿茶醛分子对接

图9 JUN-木犀草素分子对接

图10 JUN-靛玉红分子对接

KEGG 信号通路分析中IL-17 信号通路为主要作用的信号传导通路。在对多种冠状病毒研究中，IL-17 信号通路占据重要地位，例如SARS 病毒诱导了模式识别受体和IL-17通路的激活［22］。另外中东呼吸综合征冠状病毒（MERSCoV）被认为是一种感染呼吸道的高致病性病毒，具有很高的发病率和死亡率，动物模型研究表明MERS-CoV 感染可引起强烈的炎症反应，药物治疗后可相对抑制TNF-α、IL-15、IL-17 等炎症因子［23］。这些研究均与KEGG 分析结果一致。

图11 JUN-原儿茶醛分子对接

自2019 年底，起源于武汉的新型肺炎席卷全国，大量信息表明，该肺炎是一种新型冠状病毒感染所致。冠状病毒在系统分类上属冠状病毒科冠状病毒属。冠状病毒属的病毒是具外套膜的正链单股RNA 病毒，存活力较强，在适宜环境可存活5 d，且其潜伏期最长可达14 d，该病毒主要通过口液、喷嚏、接触传染，并通过空气飞沫传播，因此其危害性和传染性较大。已有研究发现新型肺炎从轻症向重症发展的时间比较长，因此发病早期是进行抗病毒治疗的关键时期。虽然目前缺乏完全被证明有效的抗病毒治疗手段，但针对发烧、乏力等症状，中药的注射剂、解热镇痛的药物都能发挥重要作用。

荆银颗粒是由多种解表药组成，且具有抗病毒、抗炎、解热、镇痛等临床作用，且方中药物药性缓和，适用于新型肺炎轻症时间长的特点。张霞等［24］采用MA-104 细胞感染模型，以利巴韦林为阳性对照药，检测到荆芥穗水溶性部位体外抗病毒活性最强。汤奇等［25］观察并证实了荆芥挥发油对鸡胚内和小鼠体内的流感病毒有预防和治疗作用。陈智［26］实验根据细胞病变效应法（CPEF 法）结合CCK-8染色法检测细胞存活率，验证了金银花对于用呼吸道合胞病毒（RSV），柯萨奇病毒B3、B5（COXB3、COXB5），肠道病毒71 型（EV71）4 种病毒感染的人喉癌上皮细胞（Hep2）均有抑制作用。同时本研究通过网络药理学结果表明荆银颗粒多种成分对多种病毒有预防或治疗作用，因此荆银颗粒对新型冠状病毒感染的肺炎可以起到一定的预防和治疗作用，对临床给药提供可靠性依据。