健脾化湿颗粒对大鼠结肠上皮细胞OCLN、AQPs 及平滑肌细胞cAMP、AC 的影响

王迎寒，刘玉玲，陈光晖，胡 楠，张晓峰

（承德医学院中药研究所，河北省中药研究与开发重点实验室，河北 承德 067000）

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一种以间歇发作或持续存在的腹痛或腹部不适，并伴排便习惯或大便性状改变为主要临床特点，而又缺乏形态学或生化异常等可用器质性疾病解释的功能性肠病。根据罗马Ⅳ诊断标准，其病程至少半年，且近3 个月内每周至少1 d 出现相关症状［1］。根据临床症状可将IBS 分为腹泻型（diarrhea-predominant irritable bowel syndrome，D-IBS）、便秘型（constipation-predominant irritable bowel syndrome，C-IBS）、混合型（mixed bowel habits irritable bowel syndrome，M-IBS）、不定型（Unclassified irritable bowel syndrome，U-IBS）［2］，其中以D-IBS 最为多见。近年来，D-IBS 发病率呈逐渐上升趋势［3］，但其病理生理学机制尚未明确，与肠道动力异常、内脏敏感性、肠黏膜渗透性的改变及肠道微生物改变、自主神经功能障碍、免疫激活、脑-肠轴调节功能异常等有关，为多方面因素共同作用的结果［4］。就D-IBS 而言，肠运动增加，肠黏膜通透性增强是腹泻产生的重要原因；而肠黏膜的渗透性与肠上皮细胞密切相关，肠道动力与肠平滑肌细胞密切相关。健脾化湿颗粒源于临床，具有理气健脾、化湿止泻作用，用于治疗D-IBS。前期实验结果亦表明，健脾化湿颗粒能调节肠动力，减轻腹泻症状，因此，本研究着眼于结肠上皮细胞和平滑肌细胞，拟从上皮细胞紧密连接蛋白（Occludin，OCLN）、水通道蛋白（aquaporins，AQPs）及平滑肌细胞中环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）、腺苷酸环化酶（adenylate cyclase，AC）着手，研究健脾化化湿颗粒止泻作用的机制。

1 材料

1.1 细胞株 结肠上皮细胞株及结肠平滑肌细胞株均购自上海拜力生物科技有限公司。

1.2 药物 健脾化湿颗粒由炙黄芪、益智仁、炒白术、茯苓、砂仁、乌药、陈皮、炒白芍、防风、炙甘草组成；采用传统水煎煮法、乙醇洗涤沉淀、减压浓缩、真空干燥，以干膏粉∶乳糖=1∶1 比例湿法制粒而成；薄层色谱法鉴别防风、陈皮、乌药、炙甘草、白术五味药材；高效液相色谱法检测炙黄芪和炒白芍的含有量，每克颗粒中炙黄芪不得少于0.15 mg/g（以黄芪甲苷计），炒白芍不得少于0.75 mg/g（以芍药苷计）［5］。健脾化湿颗粒（批号201610）由承德医学院中药研究所制备。氯化乙酰胆碱（上海士锋生物科技有限公司，批号16091902）；盐酸阿托品（天津金耀氨基酸有限公司，批号1512241）。

1.3 试剂 高糖DMEM（美国Gibco 公司，批号8115063）；胎牛血清（德国Bioclot 公司，批号1964）；大鼠cAMP 酶联免疫试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号Oct 2016）；大鼠AC 酶联免疫试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号Oct 2016）；CCK8（500 次）试剂盒（日本同仁化学研究所，批号JE603）；兔抗大鼠紧密连接蛋白抗体（Occludin，北京博奥森生物技术有限公司，批号AF09265505）；兔抗大鼠水通道蛋白3 抗体（AQP3，北京博奥森生物技术有限公司，批号AE042437）；兔抗大鼠水通道蛋白4 抗体（AQP4，北京博奥森生物技术有限公司，批号AF09221494）；0.25% 胰酶（含EDTA，北京索莱宝科技有限公司，批号20150423）；山羊抗兔IgGHRP 二抗（北京博奥森生物技术有限公司，批号AF11285098S）；兔抗大鼠β-actin 抗体（北京博奥森生物技术有限公司，批号AF04158601）；BCA蛋白定量试剂盒（北京普利莱基因技术有限公司，货号P1511）；还原型5×SDS 上样缓冲液（碧云天生物技术研究所，货号P0015）；脱脂奶粉（美国BD 公司，批号4239539）；化学发光试剂A 和B（美国 Thermo Scientific 公司，批号 P1020）；TEMED（美国Sigma 公司，批号M146）；30%丙烯酰胺（碧云天生物技术研究所，批号20161021）；过硫酸铵（北京索莱宝科技有限公司，批号1024D0313）；预染Marker（美国Thermo Scientific公司，批号00389282）；PVDF 膜（美国Millipore公司，0.45 μm）。

1.4 仪器 YT-875SB 型医用净化工作台（苏州苏杭实验动物设备厂）；MCO-15AC CO2培养箱（日本三洋公司）；HZQ-X100 恒温震荡培养箱（江苏同君仪器科技有限公司）；BH-2 型显微镜及摄像装置（日本Olympus 公司）；Multiskan MK 3 酶标仪（美国Thermo Labsystems 公司）；LD4-2A 低速离心机（北京京立离心机有限公司）；LDZX-50KBS 型立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Velocity18 r 台式高速冷冻离心机（瑞士Dynamica公司）；WD-9405B 水平摇床、DYY-7C 转印电泳仪电源（北京市六一仪器厂）；CP214 电子分析天平［奥豪斯仪器（上海）有限公司］；DYCZ-40D 迷你转印电泳仪、DYCZ-24DN 迷你双垂直电泳仪（北京市六一仪器厂）；Tanon 6100 电化学发光成像系统（北京原平皓生物技术有限公司）。

2 方法

2.1 细胞培养 收到细胞株后，镜下观察，上皮细胞呈不规则卵圆形，平滑肌细胞呈梭形，均已长满90%瓶底。常规方法按1∶3 比例进行传代扩增，调细胞浓度至5×105/mL 接种于培养瓶中，37 ℃、95% O2和5% CO2条件下培养。24 h 后换液，以后每3 d 更换培养基1 次，期间用倒置显微镜观察细胞生长情况。待细胞长满90%培养瓶底时传代，部分冻存，将第8 代细胞用于实验。

2.2 健脾化湿颗粒溶液配制 精确称定200 mg 健脾化湿颗粒粉（未加辅料），加入2 mL PBS 缓冲液，充分溶解，无菌滤膜过滤除菌，质量浓度为100 mg/mL，4 ℃保存备用。用时按比例稀释。

2.3 检测健脾化湿颗粒处理后上皮细胞存活率 采用CCK-8 法。收集长满培养瓶80%融合度的第7代结肠上皮细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，接种到96 孔板中，每孔200 μL，培养24 h 后，加入不同浓度的健脾化湿颗粒溶液，使健脾化湿颗粒的质量浓度为1.4、1.3、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mg/mL，每个质量浓度3 个复孔，孵育24、48 h 后，每孔加入10 μL CCK-8，继续孵 育2 h，用酶标仪于450 nm处测吸光度值 ［OD（45 nm）］。重复3次，选择适宜的健脾化湿颗粒浓度。

2.4 检测健脾化湿颗粒处理后上皮细胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表达 采用Western blot 法。收集长满培养瓶80%融合度的第7 代结肠上皮细胞，调整细胞浓度为5×104/mL，接种到6 孔板中，每孔3 mL，培 养24 h 后，加入健 脾化湿颗粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每个浓度3 个复孔，孵育24 h 后，弃去培养液，PBS 缓冲液洗3 次，弃去，将培养板倒扣在吸水纸上吸干液体，每孔加入200 μL 含PMSF 的裂解液，于冰上裂解30 min，经常来回摇动使细胞充分裂解。裂解完后，用干净的刮棒迅速将细胞刮下，然后将细胞碎片和裂解液移至1.5 mL 离心管中。4 ℃，12 000 r/min 离心5 min。将离心后的上清分装0.5 mL 的离心管中，每管50 μL，-20 ℃保存，重复3 次。用BCA 蛋白定量试剂盒检测各样本蛋白浓度，各样本取50 μg蛋白量上样（5%浓缩胶，12.5%分离胶），电泳至溴酚兰刚跑出边缘终止（浓缩胶80 V，分离胶120 V）。400 mA 恒流转膜3 h，一抗（OCLN 抗体1∶200，AQP3 抗体1∶200，AQP4 抗体1∶1 000；β-actin 抗体1∶2 000）4 ℃孵育过夜，室温下二抗（1∶2 000）孵育2 h，滴加电化学发光液，1 min后用Tanon 6100 电化学发光成像系统曝光拍照，曝光时间10 s。图片用WD-94BA 凝胶成像系统自带软件进行半定量分析，测定目的条带光密度值。各目的蛋白的光密度与β-actin 条带光密度的比值乘以100%作为该蛋白表达水平参数。

2.5 检测健脾化湿颗粒处理后结肠平滑肌细胞舒缩 收集长满培养瓶80%融合度的第7 代结肠平滑肌细胞，调整浓度为1×104/mL，接种到96 孔板中，每孔200 μL，培养24 h 后，加入健脾化湿颗粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每个浓度3 个复孔，并设空白对照，孵育24 h 后，用胰酶消化，收集各孔细胞，调整细胞浓度为1×104/mL，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使终浓度Ach 为1×10-8mmol/mL，阿托品为60 μmol/L，孵育30 s，最后加入30 μL 2.5%戊二醛终止反应，各组分别取20 μL 细胞悬液滴于载波片上，作为一个检体，于倒置显微镜下观察，每个检体随机测量边续视野下30 个完整细胞的长度，计算细胞平均长度，重复3 次。

2.6 检测健脾化湿颗粒处理后结肠平滑肌细胞cAMP、AC 的水平 收集长满培养瓶80% 融合度的第7 代结肠平滑肌细胞，调整细胞浓度为5×105/mL，接种到24 孔板中，每孔200 μL，培养24 h后，加入健脾化湿颗粒（0.25、0.5、1 mg/mL），每个浓度3 个复孔，并设空白对照，孵育24 h后，加入1×10-7mmol/mL Ach 或0.18 mg/mL 阿托品，使终浓度 Ach 为 1×10-8mmol/mL，阿托品 为60 μmol/L，孵育30 s，快速弃去培养上清，PBS缓冲液 洗3 次，然后每孔加入 PBS 缓冲液400 μL，反复冻融3 次，-80 ℃保存，重复3 次。严格按照ELISA 试剂盒要求检测大鼠结肠平滑肌细胞内cAM、AC 水平。

2.7 统计学分析 采用SPSS 17.0 统计软件进行数据分析，计量资料以（）表示，组间比较采用单因素方差分析。若方差齐则采用LSD 检验，若方差不齐采用Dunnett’s T3 检验，以P≤0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度的健脾化湿颗粒对结肠上皮细胞存活率的影响 健脾化湿颗粒质量浓度≤1 mg/mL时，结肠上皮细胞存活率≥90%，且24 h、48 h 趋势相同，差异无统计学意义。确定健脾化湿颗粒质量浓度分别为1、0.5、0.25 mg/mL，孵育时间为24 h，做后续研究。见图1。

3.2 健脾化湿颗粒对结肠上皮细胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表达的影响 与正常组比较，健脾化湿颗粒（1、0.5、0.25 mg/mL）上皮细胞OCLN、AQP3、AQP4 蛋白表达升高（P＜0.05，P＜0.01）。见表1、图2。

表1 健脾化湿颗粒对结肠上皮细胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表达的影响（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

表1 健脾化湿颗粒对结肠上皮细胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表达的影响（，n＝6）Tab.1 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells（，n＝6）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

图2 健脾化湿颗粒对结肠上皮细胞OCLN、AQP3，AQP4 蛋白表达的影响Fig.2 Effects of JHG on the protein expressions of OCLN，AQP3 and AQP4 in colonic epithelial cells

3.3 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞舒缩的影响 健脾化湿颗粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能增加结肠平滑肌细胞长度（P＜0.05，P＜0.01）；加入Ach 干预后，结肠平滑肌细胞长度减小（P＜0.01），而健脾化湿颗粒（1、0.5、0.25 mg/mL）能显著抑制Ach 引起的平滑肌细胞收缩（P＜0.05，P＜0.01）；加入阿托品干预后，结肠平滑肌细胞长度增加，健脾化湿颗粒（1、0.5 mg/mL）与阿托品协同作用促进平滑肌细胞舒张（P＜0.05，P＜0.01）。见表2。

3.4 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞cAMP、AC的影响 与正常组比较，健脾化湿颗粒（1、0.5 mg/mL）可降低结肠平滑肌细胞内cAMP、AC 的水平（P＜0.05，P＜0.01）；Ach 升高结肠平滑肌细胞内cAMP、AC 的水平（P＜0.01）；健脾化湿颗粒（1、0.5 mg/mL）能抑制Ach 引起的平滑肌细胞内cAMP、AC 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）；与阿托品有协同作用降低平滑肌细胞内cAMP、AC水平（P＜0.05，P＜0.01）。见表4。

表2 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞长度的影响（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

表2 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞长度的影响（μm，，n＝9）Tab.2 Effects of JHG on the length of colonic smooth muscle cells（μm，，n＝9）

注：与正常组比较，# P ＜0.05，##P ＜0.01；与Ach 组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与阿托品组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

表4 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞cAMP、AC 的影响（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

表4 健脾化湿颗粒对结肠平滑肌细胞cAMP、AC 的影响（，n＝9）Tab.4 Effects of JHG on cAMP and AC in colonic smooth muscle cells（，n＝9）

注：与正常组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与Ach 组比较，∗P＜0.05，∗∗P＜0.01；与阿托品组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

4 讨论

IBS 是临床上常见的功能性消化道疾病，以D-IBS较为多见，好发于青壮年，具有发病率高和反复发作的特征，给患者的工作和生活带来不便，且消耗大量的医疗资源。D-IBS 的病理生理学机制尚未明确，D-IBS 的发生与肠道动力异常、内脏敏感性异常、脑肠轴功能异常等因素密切相关，并通过神经系统、免疫系统、内分泌系统等多方面的综合作用导致肠道平滑肌运动障碍和水液代谢功能紊乱［6］。现代医学认为，水液的吸收部位主要在肠道，消化道内大部分水分被小肠吸收，不能被小肠吸收的水液进入结肠。如果进入结肠的水液超过了其吸收能力或者结肠吸收水液的能力下降，都会导致粪便中的水液增加，发生腹泻［7］。因此，AQPs表达减少，不能有效的转运水液；肠运动加快，使结肠不能充分吸收水液，均可以导致腹泻的发生。

AQPs 又名水孔蛋白，广泛分布于机体中，目前在消化道已发现有9 种AQPs 表达。它们分布于肠黏膜中，主要介导水液的跨膜转动，以便维持肠道细胞内外环境稳定。研究发现，AQP3 可通过介导肠腔与血管之间的水液转动调节结肠中的粪便含水量，其作用可被HgCl2或CuSO4抑制［8］；血管活性肠多肽可通过cAMP-PKA 依赖性途径上调AQP3 的表达，从而改变肠黏膜对水的通透性，调节水的跨膜运动，影响胃肠道分泌、吸收功能［9］。AQP4 主要位于结肠上皮细胞的基底外侧膜，同样参与了跨细胞水液转动，在cAMP-PKA 信号通路介导下，AQP4 异常表达在D-IBS 的病理生理过程中起关键作用［10］。

一直以来，胃肠动力异常作为IBS 的主要病理生理之一。胃肠运动依赖于胃肠道平滑肌的收缩和舒张，并受肠神经系统和中枢神经系统共同调控。随着科学技术的不断进步，对胃肠运动的研究已经从宏观的在体和离体肠管实验转到细胞层面，甚至是某个信号通路的研究。平滑肌细胞是胃肠运动的基本单位，其上分布着各种类型的受体，如激动型受体中的M 受体、5-HT 受体等，激活此类受体，可引起细胞的收缩，使肠道运动加快。

cAMP 被称为细胞内的第二信使，在G 蛋白偶联信号通路中起重要的调控作用，参与人体的各种活动。在胃肠道，cAMP 调控作用涉及黏膜层、肌层以及肠神经系统，对胃肠道的运动功能、内脏感觉及分泌功能都具有非常重要的调节作用［11］。当细胞受到外界刺激时，首先激活Gs 蛋白，再激活AC，从而产生cAMP，生成的cAMP 可进一步激活蛋白激酶A，进而影响多种蛋白的磷酸化及离子通道的激活或失活，使细胞对外界刺激产生相应反应。在结肠平滑肌中，可由M 受体活化而增加。

健脾化湿颗粒配方来源于临床，该方具有理气健脾、祛湿止泻之效，主要用来治疗D-IBS，疗效确切。本课题组前期研究［12-18］结果显示，健脾化湿颗粒可以降低D-IBS 大鼠结肠运动及内脏敏感性，其作用机制可能与调节脑肠轴功能，改善脑肠肽的水平及其受体的表达有关。在本实验中，应用CCK-8 试剂盒检测不同浓度健脾化湿颗粒对上皮细胞存活率的影响，确定1、0.5、0.25 mg/mL 为后续实验用质量浓度，孵育时间为24 h；3 个浓度的健脾化湿颗粒可显著升高上皮细胞OCLN、AQP3、AQP4 表达；均可显著增加结肠平滑肌的长度，显著抑制Ach 引起的平滑肌细胞收缩及协同阿托品促进平滑肌细胞舒张（P＜0.05，P＜0.01）；1、0.5 mg/mL 健脾化湿颗粒可显著降低平滑肌细胞内AC、cAMP 的水平，抑制由Ach 引起的平滑肌细胞内AC、cAMP 水平的升高及协同阿托品引起平滑肌细胞内AC、cAMP 水平的降低（P＜0.05，P＜0.01）。提示健脾化湿颗粒可通过增加上皮细胞OCLN、AQP3、AQP4 表达增强肠道对水液的主动吸收；亦可通过调节平滑肌细胞内AC、cAMP 的水平，从而改善平滑肌运动功能，此过程中有M受体的参与。结合前期研究结果，课题组分析健脾化湿颗粒的作用机制并不单一，对上皮细胞和平滑肌细胞的作用也不止于此，因此，在后续研究工作中，课题组还需要进一步扩展思路，深度挖掘健脾化湿颗粒治疗D-IBS 的作用机制。