miR-802靶向Hnf1B抑制胰岛素分泌的作用研究

王丹维，张方方，金 亮，吴 洁

（中国药科大学生命科学与技术学院，南京210009）

2型糖尿病是由遗传和环境等因素导致的以高血糖为主要特征的慢性非传染性疾病［1］。糖尿病可引发多种并发症，包括心脑血管疾病、肾衰竭、失明等，严重的胰岛素抵抗也是非酒精性脂肪肝病最主要的致病因素［2］，极大影响患者的生活质量，并给患者家庭和社会带来沉重的经济负担，成为全球公认的医疗卫生保健问题。因此阐明糖尿病的发病机制，探究引起糖尿病发生的新靶点，对糖尿病的诊断和防治意义重大。MicroRNA（miRNA）是一种内源的短片段非编码RNA，约含20～22个碱基，通过与mRNA的3′端非翻译区结合，引起靶基因剪切或抑制靶基因的翻译从而对其表达进行调控［3］。目前研究发现许多miRNA参与调控糖尿病的发生、发展［4-5］。比如，miR-335已被证明以编码胰岛素分泌相关的SNARE复合物成员的mRNA为靶点［6］；miR-375也被报道可通过反馈环节被高水平的葡萄糖负调控，因为其可通过靶向PDK1减弱胰岛素基因转录［7］；另有研究表明Min6细胞暴露于高葡萄糖环境可导致多个miRNA表达水平的改变，其中miR-30d被发现参与胰岛素基因转录的调节［8］；同样，小鼠胰岛中 miR-15a表达的变化与胰岛素基因 mRNA水平相关［9］。以上研究均表明，miRNA对胰岛β细胞具有重要的调控作用。但目前关于miRNA调控胰岛β细胞功能的具体机制尚未完全阐明。因此揭示并完善miRNA调控胰岛β功能的机制，是糖尿病研究领域中亟待解决的重要科学问题。

本课题组前期通过高通量测序发现与正常饮食小鼠胰岛组织相比，在高脂饮食模型小鼠胰岛组织中miR-802的表达水平显著升高。且新近研究表明，miR-802直接与 NF-κB抑制因子（NRF）的3′-UTR结合并抑制其表达，介导肥胖相关肾病［10］；同时在小鼠肝脏中miR-802的过表达损害葡萄糖耐受性，并降低胰岛素敏感性，而miR-802表达的降低则改善了葡萄糖耐量和胰岛素作用［11］。因此，miR-802对糖尿病的发生、发展发挥着重要的调控作用。

但是miR-802是否能直接调控胰岛β细胞的功能，目前尚未有文献报道。为了深入探讨miR-802对胰岛β细胞功能的调控作用，本研究利用脂质体转染法在胰岛原代细胞和Min6细胞中过表达或敲降miR-802，通过ELISA及Western blot等实验揭示miR-802胰岛β细胞的功能及其作用机制。

1 材 料

1.1 试 剂

DMEM高糖培养基、RPMI 1640完全培养基、胎牛血清（美国Gibco公司）；LipofectamineTM2000、Trizol试剂（南京诺唯赞公司）；RIPA裂解液、BCA蛋白质定量试剂盒、胰蛋白酶（上海碧云天生物公司）；割胶回收试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）；兔抗鼠 Hnf1B单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH单克隆抗体（美国Abcam公司）；miR-802类似物及其阴性对照，miR-802抑制剂及其阴性对照、miR-RNA实时荧光定量RT-PCR定量试剂盒（上海吉玛制药技术公司）；All-in-one逆转录试剂盒、实时荧光定量RT-qPCR试剂盒（美国abm公司）；V型胶原酶（美国 Sigma-Aldrich公司）；T4 DNA连接酶（日本TaKaRa公司）。

1.2 仪 器

480II实时荧光定量仪（美国 Roche公司）；Synergy荧光酶标仪（美国Biotek公司）；TS2R显微图像采集系统（日本 Olympus公司）；Trans-Blot Turbo Western blot电泳转膜仪（美国Bio-Rad公司）；4600蛋白曝光仪（上海Tanon公司）。

1.3 质粒、细胞和动物

大肠埃希菌、293T细胞、pMIR-REPORT质粒、海肾质粒、pcDNA3.1（＋）质粒、PLVX-shRNA2质粒均保存于本实验室。胰岛β细胞系Min6细胞由南京医科大学韩晓教授课题组提供。6～8周龄C57BL／6J小鼠购自扬州大学比较医学中心，许可证号SCXK（苏）2017-0007。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 细胞培养和提取

Min6细胞复苏及培养和胰岛原代细胞的提取均按文献［12］的方法进行。

2.2 细胞的转染

将miR-802类似物及其阴性对照、miR-802抑制剂及其阴性对照的干粉于常温离心机中12 000 r／min离心5 min，之后加入ddH2O溶解粉末，配制为20μmol／L的储存液，将储存液分装后于-20℃保存。取培养于6孔板中的细胞，按照LipofectamineTM2000说明书的要求进行转染，先将细胞上清换成无血清培养基饥饿培养4 h，之后将待转染的miRNA和LipofectamineTM2000按照体积比1∶2加入到无血清培养基中，并使miRNA在培养基中的终浓度为100μmol／L，6 h后换成完全培养基继续培养用于后续的实验。

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2.3 葡萄糖刺激的胰岛素分泌（GSIS）实验

将纯净的胰岛原代细胞均匀铺在12孔板中，并设置每孔中胰岛细胞的数量为30个。加入RPMI 1640完全培养基100μL（含10%胎牛血清），置于细胞培养箱平衡12 h，并将Min6细胞（1×107个）接种于12孔板，按照“2.2”项所述的转染步骤，在胰岛细胞和Min6细胞中过表达或敲降miR-802，转染 48 h后，用含 2.5 mmol／L葡萄糖的Hank′s平衡盐溶液缓冲液作为饥饿液培养6 h，之后分别用2.5和25 mmol／L的葡萄糖刺激2 h，刺激结束之后，收集细胞上清液，用小鼠胰岛素ELISA试剂盒检测上清液中胰岛素的含量，同时用细胞刮刀将接种的细胞完全刮下，收集细胞后用BCA试剂盒进行蛋白定量，用每孔胰岛素的含量（μIU）／每孔细胞蛋白含量（mg）作为胰岛素分泌能力的评价指标。

2.4 靶基因预测和双荧光素酶检测实验

根据 TargetScan（http:／／www.targetscan.org／vert＿72／），miRBase（http:／／www.mirbase.org／），miRwalk（http:／／mirwalk.umm.uni-heidelberg.de／）网站预测miR-802潜在的靶基因，利用Bibiserv2（https:／／bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de／rnahybrid／）计算靶基因与miRNA的结合自由能，将预测到的靶基因合成包含酶切位点和目的片段的3′-UTR种子序列，人工合成野生型片断上下游引物（Hnf1B-WTF／R），在野生型片断的基础上合成种子序列互补序列的突变位点，合成突变片段（Hnf1B-MU-F／R），片段长度为59 bp，序列如表1所示。

Table 1 Sequence used for luciferase report assay

将合成的单链退火，使用T4 DNA连接酶将退火产物与酶切后的pMIR-REPORT质粒进行连接重组，并将其转化进大肠埃希菌中，提取质粒。MiR-802与pMIR-REPORT重组质粒、海肾质粒共转染到293T细胞:提前将293T细胞均匀铺至24孔板中，转染3种质粒，每种设置3个平行孔。293T细胞铺板密度为每孔2×105个，体系500μL，转染前将24孔板中换成400μL不含抗生素和血清的培养基，4～6 h后开始转染。转染结束后48 h使用双荧光素酶报告试剂盒对其荧光强度进行检测。

2.5 Western blot法检测Hnf1B蛋白的表达

向上述步骤中获得的胰岛原代细胞和Min6细胞中分别加入RIPA裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂），置于冰上用细胞刮刀刮下，每隔10分钟涡旋10 s，使细胞得到充分的裂解，加入5×上样缓冲液溶液，并用PBS将蛋白浓度调整为1.0μg／μL，将制备好的样品置于100℃金属浴中煮10 min。利用5%浓缩胶和10%分离胶进行电泳，先将电压设置成80 V，待样品跑到浓缩胶和分离胶的分界线时，调整电压为140 V，整个电泳持续约90 min。将PVDF膜用甲醇活化10 min后，使用半干转印法将蛋白转移到膜上，转移后将膜置3%脱脂牛奶中室温封闭1 h。封闭结束，用TBST洗膜3次，每次10 min，加入相应的按1∶1 000稀释的一抗（兔抗鼠Hnf1B单克隆抗体、兔抗鼠GAPDH单克隆抗体），将样品在4℃冰箱中过夜孵育。一抗孵育之后，洗膜3次，每次10 min，后加入相对应的二抗孵育1 h，二抗孵育结束之后，继续洗膜3次并于曝光仪中曝光。

2.6 RNA的提取和qPCR

在转染后的细胞中加入Trizol裂解液1 mL，将细胞充分裂解后提取细胞RNA，使用qPCR试剂盒，分别将RNA反转录成普通cDNA和miR-802的cDNA，进行qPCR。qPCR过程中所使用的引物序列如表2所示。其中CYC为Hnf1B的内参；U6为miR-802的内参。

Table 2 Primers used for qPCR

2.7 质粒构建

在NCBI数据库中查找Hnf1B的编码序列，以Min6细胞的cDNA作为模板扩增Hnf1B的编码区，Hnf1B全长1 599 bp，利用割胶回收试剂盒回收所得到的片段，选用pcDNA3.1（＋）真核生物表达质粒，将回收得到的片段和pcDNA3.1（＋）质粒用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切（37℃酶切6 h），将酶切后的质粒割胶回收，利用T4DNA连接酶将质粒和片段于37℃过夜连接12 h，连接后的质粒转化至大肠埃希菌，挑取单克隆菌测序，成功构建的过表达质粒命名为 over-Hnf1B；同时空载的pcDNA3.1（＋）作为over-Hnf1B的对照质粒。利用 shRNA 数 据 库 （http:／／sirna.wi.mit.edu／home.php）设计 Hnf1B的序列，采用 Bam HⅠ和Eco RⅠ作为酶切位点，用上述同样的方法，将其构建在PLVX-shRNA2的载体上，构建成功的敲除质粒命名为sh-Hnf1B（PCR引物见表3）。利用空载的PLVX-shRNA2载体作为shHnf1B的对照质粒。

Table3 Primers used for PCR

2.8 功能回复实验

分别将30个纯净的胰岛原代细胞和1×107个Min6细胞接种于12孔板，将待实验的细胞分为4组，根据LipofectamineTM2000说明书的方法，分别转染miR-802类似物及其阴性对照、over-Hnf1B和miR-802类似物＋over-Hnf1B，转染48 h后，按“2.3”项方法进行GSIS实验，检测胰岛素的分泌能力。

2.9 统计学处理

3 结 果

3.1 miR-802在Min6和胰岛原代细胞中转染效率的验证

将miR-802类似物及其阴性对照，miR-802抑制剂及其阴性对照分别转染至Min6和胰岛原代细胞中，转染48 h后通过qPCR检测转染效率，结果如图1所示，与对照组相比，转染miR-802类似物的组中miR-802表达显著上调，在Min6细胞和胰岛原代细胞中分别上调至对照组的300倍和200倍。转染miR-802抑制剂组与对照组相比，则显著抑制了miR-802的表达，在Min6细胞和胰岛原代细胞中分别下调至对照组80%及60%，上述结果说明miR-802类似物和miR-802抑制剂可以作为上调和抑制miR-802表达的有效工具。

3.2 miR-802调控胰岛素的分泌

经葡萄糖刺激后Min6细胞和胰岛原代细胞的胰岛素分泌结果如图2所示，用高糖或低糖刺激时，过表达miR-802可明显抑制Min6细胞和胰岛原代细胞分泌胰岛素，而敲降 miR-802则促进Min6细胞和胰岛原代细胞分泌胰岛素。以上结果均表明miR-802能够调控胰岛β细胞胰岛素的分泌。

Figure 1 qPCR verified the transfection efficiency of miR-802 in Min6 cells（A）and islet primary cell（B）（x¯±s，n＝3）A:Relative miR-802 level in Min6；B:Relative miR-802 level in islet***P＜0.001

Figure 2 Effect of miR-802 on insulin secretion of Min6（A）and primary islet cells（B）（x¯±s，n＝3）*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3.3 miR-802靶基因的初步验证

利用miRNA靶基因数据库预测miR-802的潜在靶基因，结合miR-802对胰岛β细胞的生物学功能，筛选出Hnf1B为miR-802的潜在靶基因，通过软件Bibiserv2预测分析，发现miR-802与Hnf1B靶向性结合的自由能为-91.7 kJ／mol，说明Hnf1B与miR-802的结合位点具有高度保守性（图3-A），同时双荧光素酶报告基因检测结果显示，Hnf1B萤火虫荧光素酶的相对荧光强度能够被miR-802类似物抑制，但能被miR-802抑制剂增强（图3-C）。上述结果表明Hnf1B可能是miR-802的靶基因。

Figure 3 Prediction and preliminary verification of miR-802 target geneA:Target binding free energy of miR-802 and Hnf1B was predicted and analyzed by bibiserv2；B:Target binding sequence of miR-802 and Hnf1B was predicted by targetscan；C:Target relationship between miR-802 and Hnf1B was preliminarily verified by double luciferase reporter gene（±s，n＝3）***P＜0.001

3.4 Western blot和qPCR验证miR-802靶向Hnf1B

为了进一步确证miR-802靶向Hnf1B，本研究利用Western blot和qPCR进一步确认。结果如图4所示，在Min6细胞中过表达miR-802可以显著降低靶基因Hnf1B的蛋白和mRNA水平，而在Min6细胞中敲除miR-802时观察到相反的现象。

3.5 Hnf1B促进胰岛素分泌

Hnf1B是对胰腺细胞形成和维持血糖稳态具有重要作用的转录因子。为了研究Hnf1B是否能调控胰岛β细胞功能，本研究通在Min6和胰岛原代细胞中转染sh-Hnf1B和Hnf1B过表达载体，通过qPCR及Western blot验证Hnf1B的转染效率，结果显示Hnf1B在Min6细胞中过表达约300倍，降低至70%（图5-A）；在胰岛原代细胞中Hnf1B被过表达约250倍降低至70%（图5-B）。接着在Min6细胞及胰岛原代细胞中开展GSIS实验，ELISA检测结果显示Hnf1B可以显著促进Min6细胞（图5-C）和胰岛原代细胞（图5-D）分泌胰岛素。以上结果表明Hnf1B可调控胰岛β细胞分泌胰岛素。

Figure 4 Effects of miR-802 on the protein and mRNA expression of Hnf1B in Min6 cells（x¯±s，n＝3）.***P＜0.001

Figure5 Effect of Hnf1B on the secretory function of isletβcells.Overexpression and knockdown of Hnf1B in Min6 and primary islet cells respectively A:Changes in protein and mRNA levels of Hnf1B in Min6 cells；B:Changes in protein and mRNA levels of Hnf1B in primary islet cells；C:Effects on insulin secretion in Min6 cells；D:Effects on insulin secretion in primary islet cells（±s，n＝3）*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

3.6 miR-802靶向Hnf1B抑制胰岛β细胞分泌胰岛素

为了进一步验证miR-802是否通过靶向Hnf1B调控胰岛素的分泌，在Min6细胞和胰岛原代细胞中转染miR-802类似物和Hnf1B过表达载体，结果如图6-A和6-B显示，与单转染miR-802类似物组相比，共转染Hnf1B和miR-802类似物组可回复miR-802降低的胰岛素分泌能力，以上结果表明miR-802是通过靶向Hnf1B抑制胰岛素分泌。

Figure 6 MiR-802 targeting Hnf1B regulates the secretion of isletβcells.Co-transfected miR-802 mimics and Hnf1B in Min6 and primary islet cells for 48 h（x¯±s，n＝3）A:Insulin secretion in Min6 cells；B:Insulin secretion in primary islet cells**P＜0.001

4 讨 论

肝细胞核因子 1α（Hnf1A）和 Hnf1B（或vHNF1）是在肝、肾、肠道和胰腺β细胞中表达的密切相关的转录因子［13］。其最初被发现为单基因糖尿病基因，临床特征包括胰腺发育不全和外分泌功能不全。来自动物模型的数据表明，Hnf1B对于胰腺和肝脏发育的多个阶段至关重要［14］。Hnf1B的分子改变与多器官疾病有关［15-16］，包括5岁以下儿童的成熟期糖尿病（MODY5，HNF1β-MODY）［17-18］，外分泌胰腺的形态和功能异常［19］。另有研究表明Hnf1B突变携带者具有高胰岛素血症并伴有胰岛素抵抗［20］。新近研究显示Hnf1B通过调控PPARγ信号通路参与调控胰岛素抵抗［15］，以上研究均说明Hnf1B可能参与胰岛β细胞功能的调控。同时，Hnf1B可能与PAX6启动子结合，直接控制 PAX6的表达［21］，许多证据表明，PAX6的任何改变（过度表达和限制性表达）均能对血糖产生影响，从而参与了糖尿病的发生与发展。PAX6有望成为治疗糖尿病的新的发展方向［22］，也为进一步深入研究提供新的依据。

本次研究通过在Min6细胞和胰岛原代细胞中转染 miR-802的模拟物和抑制剂，发现过表达miR-802会抑制胰岛β细胞胰岛素的分泌，利用生物信息学预测并经过双荧光素酶报告系统、Western blot等实验确证了Hnf1B是miR-802的靶基因；最后通过功能回复实验证明了miR-802是通过靶向Hnf1B，从而抑制胰岛素分泌。本研究首次阐明了miR-802可以参与胰岛β细胞功能的调控，初步探讨其调控机制，为糖尿病的发生发展提供一定的理论基础。