干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共培养上清液对小鼠抗生素相关性腹泻的治疗作用及机制

鲍小强

（中国药科大学基础医学与临床药学学院，南京210009）

抗生素相关性腹泻（antibiotic associated diarrhea，AAD）是临床常见腹泻类型，与抗生素应用有关。近年来，随着感染性疾病发病率逐渐升高及广谱抗生素滥用现象加重，AAD发生率随之增加，有调查显示［1］，其发病率达5%～39%，尤其是小儿患者更易发生AAD，给患儿生长发育造成不利影响。目前，临床中多采用停用抗生素或更换窄谱抗生素治疗AAD，治疗效果均不理想，甚至部分患者出现腹泻症状加重现象。研究发现，AAD患者存在肠道微生态失衡、肠黏膜屏障功能受损及免疫功能下降等现象［2］，因此，亟需寻找有效药物改善肠道微生态、黏膜屏障及免疫功能对疾病治疗有重要意义。近年来研究发现，微生态制剂具有调节肠道微生态作用，且安全性较好，成为临床研究热点［3］。干酪乳杆菌（Lactobacillus casei，LC）、纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtiliis natto，BN）是目前常用于制备微生态制剂的菌种，临床已有应用LC或BN单一微生态制剂治疗化疗相关性腹泻的报道［4］，取得良好效果，但仍有部分患者治疗效果不佳。共培养是应用两种或两种以上微生物共同发酵，以获得更高受益的一种发酵技术［5］，为探讨更好的治疗AAD方法，本研究利用LC与BN间的互利共生关系，将二者的共培养上清液应用于AAD小鼠治疗中，重点探讨其对AAD小鼠肠道微生态、黏膜屏障功能及免疫功能的影响，为临床治疗提供理论基础。

1 材 料

1.1 药品与试剂

LC、BN（中国普通微生物菌种保藏管理中心）；盐酸林可霉素注射液（山东新华制药股份有限公司，规格:2 mL∶0.6 g，批号1807110701）；乳杆菌、双歧杆菌、肠杆菌、肠球选择性培养基（青岛海博生物计数有限公司）；粪便QIAamp®DNA Stool Mini Kit（德国Qiagen公司）；小鼠分泌型免疫球蛋白 A（secreted immunoglobulin A，sIgA）试剂盒（美国 Rapidbio公司）；白介素（interleukin，IL）-2、IL-4 ELISA试剂盒（美国R＆D公司）；紧密连接相关蛋白-1（tight junction-associated protein-1，ZO-1）、闭锁蛋白（Occludin）、β-actin多抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠和山羊抗兔IgG（美国Abcam公司）。

1.2 仪 器

HD325C型生物切片机（湖北医疗器械七厂）；E200型光学显微镜（Nikon仪器上海有限公司）；3550UV酶标仪、7500实时荧光定量PCR仪（美国Bio-rad公司）。

1.3 动 物

SPF级昆明种小鼠，50只，雌雄各半，4周龄，13～15 g，由中国药科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（苏）2018-0004。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

2.1 LC、BN共培养上清液制备

将BN、LC按照菌体数1∶2比例接种于优化培养基（葡萄糖、蔗糖、酵母浸粉、麸皮、硫酸锰、硫酸镁、无水乙酸钠、磷酸二氢钾分别占比1.32%、0.68%、1.50%、0.50%、0.005%、0.02%、0.05%、0.20%）中，接种量为4%，装液量40%，温度设置为37℃，静置培养30 h，离心获得共培养上清液；同时分别单独接种LC、BN，获得上清液，4℃保存备用（活菌数约1×1011CFU／L，干质量约39 g／L）。

2.2 模型制备及分组干预

选取小鼠50只，其中40只参照文献［6］建立AAD小鼠模型:每次给予灌胃盐酸林可霉素0.4 mL，每日2次，连续4 d，观察小鼠排便情况，出现黄褐色、稀烂、不成形粪便，且新鲜粪便培养双歧杆菌、乳杆菌数量下降，则建模成功，将建模成功小鼠随机分为模型组、LC组、BN组及共培养组；其余10只小鼠灌胃生理盐水，设为对照组。第5 d开始LC组、BN组及共培养组分别灌胃LC、BN及共培养上清液30 mL／kg，模型组和对照组分别灌胃等量生理盐水溶液，连续给药4 d，所有小鼠均自由饮水和采食。

2.3 观察小鼠一般情况及样本采集

观察干预期间各组小鼠精神状态、采食量、粪便等一般情况；末次给药2 h，称重后处死各组小鼠，立即剖检取脾脏及胸腺，剔除表面筋膜及脂肪组织，称重并计算脾脏和胸腺的体质量比。

2.4 组织病理学观察

取近端结肠病变区组织，对照组取同位置健康组织，10%中性甲醛固定，酒精脱水、石蜡包埋，制作厚度为4μm的石蜡切片，行常规苏木精-伊红（HE）染色，以中性树胶封片，显微镜下拍照观察结肠组织病理学改变。

2.5 盲肠内容物菌群丰度及多样性检测

无菌收集各组小鼠盲肠内容物，采用粪便DNA基因组提取试剂盒提取总DNA，进行细菌16SrDNA V4可变区聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增，引物序列如下。F:5′-ATGCTACGTAGCTAGCT-3′； R:5′-TATCGTACGTAGCTCAC-3′，反应条件:98℃预变性4 min；98℃变性30 s，50℃退火45 s，72℃延伸30 s，重复27个循环，72℃延伸5 min。应用Illumina Misq技术对PCR产物进行高通量测序，对测序结果进行分析、处理后获得代表序列，按照0.97相似度进行聚类，以获得操作分类单元（operational taxonomic unit，OUT），应用软件 MEGAN分析计算多样性（Shannon）指数和丰富度（Chao）指数。

2.6 盲肠内容物优势菌群检测

无菌收集各组小鼠盲肠内容物100μg，加入稀释液800μL充分混匀，再次稀释，选取1×10-3～1×10-8稀释度混悬液接种至选择性培养基，分别放置于37℃培养箱和厌氧菌培养箱中培养24 h，进行细菌鉴定及计数，用对数值代表活菌的优势菌数量（lgCFU／g）。

2.7 肠道屏障功能血清二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）及细菌异位率检测

处死前收集各组小鼠眼球血样，室温静置分层后，4℃离心收集上层血清，应用分光光度计法测定血清DAO水平，于酶标仪436 nm处读取吸收度。无菌获取小鼠肠系膜淋巴结（mesenteric lymph nodes，MLN）、腹腔灌洗液、肝、肾、肺，分别置于增菌液，需氧条件培养24 h，或厌氧条件培养48 h（35℃），挑取增菌培养阳性标本涂片鉴定，有大肠埃希菌或类杆菌者记为阳性，计算细菌异位率。细菌异位率（%）＝阳性器官个数／（小鼠只数 ×5）。

2.8 肠黏膜中sIgA及肠组织中 IL-2、IL-4水平检测

取各组小鼠紧邻回盲部2 cm肠段组织，纵向铺平，生理盐水轻轻冲洗表面，然后用载玻片刮取肠道内容物及黏液，加入磷酸盐缓冲液（PBS）1.0 mL匀浆，1 000 r／min离心15 min；另收集上清液取近端结肠病变区组织，同法匀浆、离心收集上清液，采用ELISA法检测肠黏膜内sIgA及肠组织中IL-2、IL-4含量，严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，应用酶标仪测定 492 nm（sIgA）或450 nm（IL-2、IL-4）波长处吸收度，根据标准曲线计算待检样品含量。

2.9 肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达情况检测

取各组小鼠紧邻回盲部肠段组织75 mg，加入液氮研磨，加入细胞裂解液，至于沸水浴10 min，12 000 r／min离心15 min取上清液，采用BCA法测定蛋白总量，取样本30μg与等体积上样缓冲液混匀，再次离心取上清液，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰氨凝胶电泳 SDS-PAGE），电转仪转膜60 min，加入封闭液孵育2 h，洗膜3次后加入稀释一抗，4℃摇床孵育过夜，加入稀释二抗，常温孵育1 h，暗室中曝光、显影。应用Quantity One软件进行灰度分析，以待测蛋白与内参β-actin灰度比值表示其相对表达量。

2.10 统计学分析

统计学工具SPSS 20.0分析处理数据，计量资料均以（±s）描述，多样本计量资料比较采用单因素方差分析，进一步两两样本比较采用SNK-q检验。P＜0.05有统计学意义。

3 结 果

3.1 各组小鼠一般状态观察及胸腺、脾脏的体质量比对比

连续灌胃4 d盐酸林可霉素后，40只小鼠均建模成功，将其分为模型组、LC组、BN组及共培养组，各10只。对照组小鼠，精神状态、采食量、粪便性状均无异常；模型组小鼠造模初期采食量下降、毛色暗淡，随时间延长，出现活动量减少、喜卧、体质量下降、粪便溏泄；LC、BN及共培养组干预后，上述状态均有所改善，体质量有所回升，粪便性状改善，逐渐成型，其中共培养组恢复情况最佳。与对照组相比，模型组胸腺、脾脏的体质量比均较低（P＜0.05）；与模型组相比，各干预组胸腺、脾脏的体质量比均较高（P＜0.05），其中共培养组胸腺、脾脏的体质量比高于LC组、BN组（P＜0.05），而LC组与 BN组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表 1。

Table 1 Thymus and spleen weight ratios of different interrention mice（x¯±s，n＝10）

3.2 肠道组织病理学观察

HE染色结果显示，对照组肠壁结构、形态等均无异常；模型组肠壁组织结构破坏严重，组织绒毛脱落，可见纤维素样渗出、上皮细胞坏死、大量炎性细胞浸润；LC和BN组肠壁结构基本恢复正常，但仍见少量肠黏膜上皮细胞水肿及少量炎性细胞浸润，共培养组肠壁结构基本正常，无黏膜损伤，但仍见少量炎性细胞浸润（见图1）。

Figure 1 Intestinal histopathological observation（HE，×400）A:Control；B:Model；C:LC；D:BN；E:Co-culture

3.3 盲肠内容物菌群丰度及多样性对比

与对照组相比，模型组Shannon、Chao指数较低，乳杆菌数、双歧杆菌数较少，肠杆菌数、肠球菌数较多（P＜0.05）；与模型组相比，各干预组Shannon、Chao指数较高，乳杆菌数、双歧杆菌数较多，肠杆菌数、肠球菌数较少（P＜0.05）；与LC组、BN组比较，共培养组Shannon、Chao指数较高，乳杆菌数、双歧杆菌数较多，肠杆菌数、肠球菌数较少（P＜0.05）；LC组与 BN组 Shannon、Chao指数及优势菌群数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表2）。

Table 2 Comparison of intestinal flora abundance and diversity（±s，n＝10）

Table 2 Comparison of intestinal flora abundance and diversity（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group Shannon index Chao index Enterobacter／（lgCFU／g）Enterococcus／（lgCFU／g）Lactobacillus／（lgCFU／g）Bifidobacterium／（lgCFU／g ）Control 4.19±0.35 820.50±46.27 7.41±0.77 7.01±0.54 8.91±0.72 8.94±0.71 Model 2.42±0.21* 604.31±32.29* 10.31±0.86* 8.76±0.67* 6.52±0.59* 6.21±0.62*LC 2.96±0.28*△ 682.02±35.46*△ 9.49±0.81*△ 8.12±0.61*△ 7.11±0.61*△ 7.39±0.69*△BN 2.98±0.30*△ 685.48±38.62*△ 9.50±0.87*△ 8.11±0.58*△ 7.15±0.65*△ 7.40±0.70*△Co-culture 3.54±0.31*△▲＃ 733.89±40.81*△▲＃ 8.34±0.88*△▲＃ 7.56±0.51*△▲＃ 8.02±0.70*△▲＃ 8.10±0.85*△▲＃

3.4 肠道屏障功能对比

与对照组相比，模型组血清DAO、细菌异位率均较高（P＜0.05）；与模型组相比，各干预组血清DAO、细菌异位率均较低（P＜0.05），其中共培养组血清 DAO、细菌异位率均低于 LC组、BN组（P＜0.05）；LC组与BN组比较、对照组与共培养组比较，血清DAO、细菌异位率差异无统计学意义（P＞0.05）（见表3）。

3.5 肠黏膜中 sIgA、肠组织中 IL-2、IL-4水平及IL-2／IL-4对比

与对照组相比，模型组sIgA、IL-2及IL-2／IL-4均较低，IL-4较高（P＜0.05）；与模型组相比，各干预组 sIgA、IL-2及 IL-2／IL-4均较高，IL-4较低（P＜0.05）；与LC组、BN组比较，共培养组 sIgA、IL-2及 IL-2／IL-4均较高，IL-4较低（P＜0.05）；LC组与BN组比较、共培养组与对照组比较，sIgA、IL-2、IL-4水平及 IL-2／IL-4差异均无统计学意义（P＞0.05）（见表4）。

Table 3 Comparison of intestinal barrier function（±s，n＝10）

Table 3 Comparison of intestinal barrier function（±s，n＝10）

DAO:diamine oxidase*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group Serum DAO（A）Bacterial ectopic rate／%Control 0.180±0.020 15.71±1.97 Model 0.381±0.024* 52.30±5.22*LC 0.215±0.021*△ 29.15±3.10*△BN 0.210±0.018*△ 29.03±2.38*△Co-culture 0.182±0.014△▲＃ 16.32±2.11△▲＃

Table4 sIgA in intestinal mucosa，IL-2 and IL-4 levels in intestinal tissue and IL-2／IL-4 comparison（±s，n＝10）

Table4 sIgA in intestinal mucosa，IL-2 and IL-4 levels in intestinal tissue and IL-2／IL-4 comparison（±s，n＝10）

*P＜0.05 vs control group；△P＜0.05 vs model group；▲P＜0.05 vs LC group；＃P＜0.05 vs BN group

Group SIgA／（μg／mL） IL-2／（pg／mL） IL-4／（pg／mL）IL-2／IL-4 Control 1.12±0.09 175.50±10.20 60.55±5.53 2.90±0.24 Model 0.73±0.06* 140.32±9.62* 138.89±10.25* 1.01±0.12*LC 0.85±0.07*△ 149.77±8.74*△ 118.57±10.31*△ 1.26±0.20*△BN 0.86±0.08*△ 150.22±8.95*△ 117.32±9.27*△ 1.28±0.13*△Co-culture 1.05±0.10△▲＃ 170.61±9.30△▲＃ 65.42±6.20△▲＃ 2.60±0.21*△▲＃

3.6 肠组织中ZO-1、Occludin蛋白相对表达量比较

与对照组相比，模型组肠组织中ZO-1、Occludin蛋白相对表达量均较低（P＜0.05）；与模型组相比，各干预组肠组织中ZO-1、Occludin蛋白相对表达量均较高（P＜0.05），其中共培养组肠组织中ZO-1、Occludin蛋白相对表达量高于LC组、BN组（P＜0.05），而LC组与BN组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（见表5，图2）。

Table 5 Comparison of relative expressions of ZO-1 and Occludin in intestinal tissues（x¯±s，n＝10）

Figure2 Expression of ZO-1 and Occludin in intestinal tissues detected by Western blotA:Control；B:Model；C:LC；D:BN；E:Co-culture

4 讨 论

AAD是腹泻常见类型，任何年龄均可发病，多见于老年人、小儿及长期应用抗生素者，以腹痛、水样泻为典型症状，严重者可出现血便、甚至休克现象，危及患者生命［7］。AAD主要包括单纯腹泻、结肠炎及伪膜性肠炎3个类型，发病机制主要为抗生素大量应用，肠道益生菌被抑制，肠道微环境中乙酸、丙酸等有机酸异常升高，导致肠道上皮细胞功能紊乱、通透性改变，最终导致腹泻发生［8-9］。因此，抗生素引起肠道微生态失衡、黏膜屏障功能障碍在AAD发生发展中起重要作用，且黏膜屏障功能对维持肠道正常免疫功能有重要意义，因此，从调节肠道微生态、改善屏障功能和免疫功能着手是提高AAD治疗效果的关键。

LC主要分布于口腔、肠道内容物及阴道中，属于乳杆菌属；BN广泛分布于自然界及动物及人肠道中，属于可形成内生孢子的革兰阳性杆菌，稳定性强，对储藏条件要求不严格，且可耐受胃内酸性环境，LC及BN均是临床中广泛应用于生产微生物制剂的益生菌［10］。赵谋明等［11］研究发现，BN液态发酵代谢物中含有纳豆激酶（nattokinase，NK）、肽类等活性物质，而NK已被证实具有抗氧化、强溶栓功效。另有研究发现，吡咯喹啉醌（pyrroquinoline quinone，PQQ）是 BN发酵后生成的另一种活性代谢物，PQQ作为氧化还原酶的辅酶，广泛分布于组织器官中，是机体生长发育的必需因子，同时具有刺激微生物生长的作用［12］。研究表明，乳酸菌、纳豆菌等益生菌之间具有互利共生关系［13］，徐微微等［14］研究证实 BN与 LC接种比为1∶2时可使共培养液中NK活力及PQQ浓度达到最大。本研究应用LC、BN上清液及共培养上清液（BN、LC接种比1∶2）干预后，各组小鼠腹泻、采食量等一般状况及肠道组织病理情况均有所改善，其中共培养组恢复情况最佳，说明LC和BN共培养上清液有助于AAD病情恢复。此外，本研究中各干预组胸腺、脾脏体质量比、Shannon指数、Chao指数、乳杆菌数、双歧杆菌数均高于模型组，其中共培养组高于LC组、BN组；各干预组肠杆菌数、肠球菌数均低于模型组，其中共培养组低于LC组、BN组，提示LC和BN共培养上清液在提高AAD小鼠肠道菌群丰度及多样性方面有积极促进作用，有助于改善肠道微生态。

生理状态下，肠道各菌群间处于共生与拮抗平衡状态，AAD状态下，肠道微生态平衡被打破，细菌多样性及优势菌群改变，导致有害代谢产物增多，肠道屏障功能及免疫功能均受到影响。DAO是分布于小肠黏膜上层绒毛中的一种胞内酶，其血清水平升高提示血清水平升高提示肠道屏障功能受损［15］；当肠道屏障功能受损或肠道通透性升高时，可出现肠道细菌异位现象［16］，可引起肠源性感染。本研究应用LC、BN上清液及共培养上清液干预后，各干预组血清DAO、细菌异位率、肠组织IL-4均较低，其中共培养组低于LC组、BN组，提示共培养上清液可有效抑制细菌异位的发生发展，改善AAD肠道屏障功能。紧密连接蛋白家族成员ZO-1、Occludin蛋白是维持肠黏膜屏障功能完整性的重要蛋白，本研究经Western blot检测发现，干预后肠组织中ZO-1、Occludin蛋白表达升高，其中共培养组升高最为明显，进一步证实LC和BN共培养上清液可能通过促进肠道紧密连接蛋白表达，进而改善肠道黏膜屏障功能。sIgA是肠黏膜免疫中的关键抗体，其水平降低提示机体黏膜免疫功能被抑制，加剧疾病进程［17］。IL-2、IL-4是分别由 Th1、Th2细胞分泌的活性因子，同时IL-2、IL-4参与调节Th0细胞向Th1、Th2细胞分化过程，在机体细胞免疫及体液免疫中发挥重要作用［18］。生理状态下Th1、Th2处于动态平衡状态，两者失衡可导致机体免疫功能失调，加速疾病进展。本研究应用LC、BN上清液及共培养上清液干预后，各干预组肠黏膜中sIgA、肠组织IL-2及IL-2／IL-4均较高，其中共培养组高于LC组、BN组，提示LC和BN共培养上清液在改善AAD肠道免疫功能方面有积极促进作用。

综上所述，LC和BN共培养上清液可有效调节AAD小鼠肠道微生态，改善肠黏膜屏障功能，提高肠道局部及整体免疫功能，为临床应用共培养益生菌制剂治疗AAD提供了理论依据。