垂盆草苷对幼龄肝内胆汁淤积大鼠的作用机制

2020-05-12向华夏

中国药科大学学报 2020年1期

向华夏，康权*

（1重庆医科大学附属儿童医院肝胆外科，重庆400014；2重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所干细胞实验室，儿童发育疾病研究教育部重点实验室，国家儿童健康与疾病临床医学研究中心，儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地，儿科学重庆市重点实验室，重庆400014）

胆汁淤积是指胆汁形成、分泌和摄取中某一环节发生障碍导致胆汁流通不畅而引起的临床症状［1］。临床表现主要有黄疸、皮肤瘙痒、大便颜色变浅、尿色深等。按发生部位可分为肝内胆汁淤积和肝外胆汁淤积，其中，肝内胆汁淤积在肝脏疾病中十分普遍，可见于急性和慢性肝病、药物性肝炎、妊娠性肝炎以及自身免疫性肝病等［2］。新生儿肝内胆汁淤积症［3］就是新生儿发病率较高的肝脏疾病，表现为结合性高胆红素血症伴黑尿，其发病率在1∶500到1∶5 000之间。据报道，垂盆草对于各种肝病都有一定的治疗效果［4-5］，这给胆汁淤积的治疗提供了一定的参考和启示。

研究发现垂盆草粗提物对于胆汁淤积模型大鼠具有一定的治疗效果［6］，其主要活性成分是垂盆草苷［7］（sarmentosin，SA），其主要的生物活性为保肝降酶作用。但是关于SA抗肝内胆汁淤积的报道过少且不全面。因此，本研究基于SA抗肝内胆汁淤积的作用研究，通过观察SA对幼龄大鼠的胆汁流量及代谢酶的影响，胆汁酸转运蛋白及合成蛋白的表达来评价SA的作用机制，为其临床用药提供可靠的实验依据。

1 材料

1.1 试剂

羧甲基纤维素钠（CMC-Na），垂盆草苷（SA，纯度为97%，上海赫彭生物科技有限公司）；熊去氧胆酸（UDCA，成都普思生物有限公司）；α-萘异硫氰酸酯（ANIT，美国Sigma公司）；丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活性和总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、总胆汁酸（TBA）试剂盒（山东博科生物有限公司）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、γ-干扰素（INF-γ）、白细胞介素 1β（IL-1β）检测试剂盒（南京建成生物有限公司）；DMEM培养基、胰酶、胎牛血清、RIPA细胞裂解液、蛋白质上样缓冲液、PBS缓冲液、TBST缓冲液；PVDF膜、电泳缓冲液、转膜缓冲液、EPS300电泳液（北京索莱宝科技有限公司公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒、FXR（farnesoid X receptor）抗体、SHP-1（small heterodimer partner-1）抗体、SHP-2抗体、CYP7A1抗体、CYP27A1抗体、MRP2（multidrug resistance-associated protein-2）抗体、BSEP（bile salt export pump）抗体、NTCP（sodium taurocholate cotransporting polypeptide）抗体、β-actin抗体购自于（上海碧云天生物技术有限公司）；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 仪器

BK-200分立式全自动生化分析仪（山东博科生物有限公司）；AD200l-P高速分散匀浆机（上海平轩科学仪器有限公司）；Tecan Infinite F50酶标仪（瑞士Tecan公司）；Ti-S型倒置荧光显微镜（日本尼康公司）；TGL-20M型台式高速冷冻离心机（厦门森态仪器仪表有限公司）；Tanon5200化学发光成像系统、VE180微型垂直电泳槽、VE186转移电泳槽（上海天能科技有限公司）。

1.3 动物

SPF级SD雄性大鼠（3周龄，100±20 g）由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号:SYXK（渝）2017-0012。大鼠饲养于重庆医科大学附属儿童医院动物中心清洁级动物房。之后相关动物实验均在动物中心操作间进行。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方法

2.1 动物分组

48只幼龄雄性SD大鼠，适应性饲养1周，使其充分熟悉环境，然后随机分为6组，每组8只，具体为:正常组（Control），模型组（Model，ANIT 80 mg／kg），阳性对照组（UDCA，100 mg／kg），垂盆草苷低剂量组（SA-L，20 mg／kg）、中剂量组（SAM，40 mg／kg）和高剂量组（SA-H，80 mg／kg）。

2.2 大鼠胆汁淤积模型构建

除正常组和模型组大鼠灌胃等量溶剂CMC-Na溶液外，其余各组大鼠均各自按照相应的给药剂量连续灌胃1周。在第5日除正常组外的其余各组大鼠均一次性灌胃80 mg／kg ANIT造模，正常组大鼠一次性灌胃等量溶剂橄榄油。在整个给药周期中，观察各组大鼠的一般状况、皮毛变化、有无死亡情况等。造模后48 h开始收集实验样本并处理。

2.3 胆汁收集

用20%乌拉坦溶液麻醉大鼠，然后固定于大鼠固定板上，进行胆管胆汁引流手术。剪开大鼠腹腔，用注射针头轻轻在胆总管上戳开一道小口，用PE-10插管插入胆总管后固定，有黄色胆汁流出即开始计时，用EP管收集0～45 min内的胆汁流量（μL）。

2.4 血清生化指标检测

对大鼠进行眼眶采血，常温静置1 h，5 000 r／min转速下离心15 min，取上层血清放置于4℃温度下保存，然后取血清采用全自动生化分析仪检测大鼠血清中丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活性和总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、总胆汁酸（TBA）的活性水平。

2.5 肝组织病理学检查

处死大鼠，取大鼠肝脏用多聚甲醛固定，经乙醇常规脱水、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色、封片、光学显微镜下观察肝脏组织的病理学变化。

2.6 肝组织中 MDA、SOD、GSH-Px检测

取一部分肝组织用生理盐水制成10%的组织匀浆溶液，在4℃下10 000 r／min离心10 min，取上清液，按照丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）试剂盒说明书测定肝脏相应氧化应激水平的含量。

2.7 血液中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β检测

取一部分血清依照肿瘤坏死因子（TNF-α）、γ干扰素（IFN-γ）和白介素1β（IL-1β）试剂盒说明书测定 TNF-α、IFN-γ和 IL-1β的表达。

2.8 Western blot法分析胆汁酸转运蛋白和合成蛋白的表达

取大鼠肝组织约50 mg，用PBS溶液清洗3遍，然后剪碎，加入RIPA蛋白质裂解缓冲液1 mL，冰上充分匀浆30 min，于4℃以10 000 r／min离心10 min，取上清液用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其蛋白质浓度。安置电泳装置后，在10%SDSPAGE凝胶上电泳分离，调整蛋白上样量为30μg，80 V电压电泳至跑完浓缩胶，约30 min，然后将电压调至120 V，跑完分离胶，约60 min，然后转移到PVDF膜上。将膜在5%BSA中封闭1 h，用TBST洗涤3次，每次5 min，然后将PVDF膜放入相应的FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP、β-actin一抗中，在 4℃下孵育过夜，第2天将一抗封闭后的PVDF膜用TBST洗涤3次，每次5 min。然后将PVDF膜加入相应的二抗孵育1 h，然后用PBST洗涤3次，每次10 min。用ECL显色液显色。以β-actin为参比蛋白对FXR、SHP-1、SHP-2、CYP7A1、CYP27A1、MREP2、BSEP、NTCP进行分析。

2.9 统计学分析

应用软件SPSS 19.0、Image J对结果进行数据处理，各组数据以±s表示，多组间比较采用多因素方差分析（One Way ANOVA，P＜0.05认为差异有统计学意义，P＜0.01是显著性差异。

3 结果

3.1 垂盆草苷对胆汁流量的影响

胆汁流量是考察ANIT诱导的大鼠肝损伤模型是否造模成功的最直观指标。结果如表1所示，与正常组相比，模型组大鼠胆汁流量被明显抑制（P＜0.01），说明造模成功。与模型组相比，UDCA组大鼠的胆汁流量显著增加（P＜0.01），垂盆草苷低剂量组无统计学意义，垂盆草苷中剂量组胆汁流量有一定的增加（P＜0.05，P＜0.01），垂盆草苷高剂量组胆汁流量显著增加（P＜0.01），且胆汁流量的恢复呈剂量依赖性。

3.2 垂盆草苷对血清生化指标的影响

如表2所示，模型组大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA含量水平较正常组均显著升高（P＜0.01），说明ANIT造模成功；与模型组相比，UDCA组大鼠血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和TBA水平显著下降（P＜0.01）；垂盆草苷低剂量组大鼠血清中的ALT、TBIL和DBIL水平降低（P＜0.05）；垂盆草苷中、高剂量组大鼠血清中的 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL和 TBA水平显著降低（P＜0.05，P＜0.01）。垂盆草苷对于生化指标的影响呈剂量依赖性，其中，垂盆草苷高剂量组降低血清中的AST与AST水平优于阳性对照组，降低ALP、TBIL、DBIL和TBA水平与UDCA相近，说明垂盆草苷高剂量组与UDCA组作用相当。

Table 1 Effect of sarmentosin（SA）on bile flow rate within 45 min in rats（±s，n＝8）

UDCA:Ursodeoxycholic acid**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） Bile flow rate／［μL／（min·100 g ）］0 15 15 30 30 45 min Control - 10.43±2.53 11.14±2.31 8.79±1.55 Model 80 2.64±0.87** 2.95±0.65** 2.20±0.41**UDCA 100 8.49±1.10＃＃ 9.24±1.24＃＃ 7.23±0.66＃＃SA 20 3.38±0.46 4.27±0.92 2.76±0.69 40 5.52±1.65＃ 7.91±0.68＃＃ 4.23±0.82＃＃80 7.24±1.07＃＃ 9.02±0.72＃＃ 7.04±1.04＃＃

Table 2 Effect of SA on alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST），alkaline phosphatase（ALP），total bilirubin（TBIL），direct bilirubin（DBIL）and total bile acid（TBA）in serum of rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg）ALT／（U／L）AST／（U／L）ALP／（U／L）TBIL／（μmol／L）DBIL／（μmol／L）TBA／（μmol／L）Control - 36.28±3.62 134.81±25.77 54.34±15.45 6.63±3.38 3.06±1.14 47.93±8.17 Model 80 161.75±27.96**305.79±38.39**143.88±25.88**44.25±8.31**25.94±4.88**145.85±19.34**UDCA 100 48.65±10.82＃＃ 142.48±29.68＃＃ 59.7±10.91＃＃ 8.13±2.42＃＃ 5.68±1.54＃＃ 57.96±7.82＃＃SA 20 136.95±24.36＃ 277.63±32.26 131.49±14.95 36.75±5.99＃ 20.5±3.89＃ 131.34±15.76 40 90.1±10.26＃＃ 205.09±29.53＃＃ 85.91±11.75＃＃ 18.25±3.49＃＃ 14.01±2.57＃＃ 102.15±8.48＃＃80 46.01±8.59＃＃ 135.85±35.50＃＃ 62.9±9.91＃＃ 8.5±1.60＃＃ 6.73±1.17＃＃ 67.03±17.94＃＃

3.3 垂盆草苷对肝脏组织病理学的影响

如图1所示，正常组大鼠肝脏组织结构形态正常，细胞排列整齐紧密，未出现变性坏死的状态（图1-A）；模型组大鼠肝脏组织受损严重，遭到严重破坏，中央静脉充血严重，出现明显的炎症浸润现象，说明造模成功（图1-B）；与模型组相比，UDCA组大鼠肝细胞坏死明显减少，肝细胞形态结构较为完整，中性粒细胞浸润明显减少，未出现明显的炎症浸润现象（图1-C）；垂盆草苷低剂量组大鼠肝组织形态结构出现好转，但是中央静脉区周围肝细胞坏死，中央静脉未出现严重的充血现象，同时有少量的炎症浸润现象（图1-D）；垂盆草苷中剂量组大鼠肝组织可见大部分肝细胞形态结构完整，中央静脉区出现少量充血现象和炎症浸润现象（图1-E）；垂盆草苷高剂量组与UDCA组类似，肝组织中细胞形态结构保持完整，中央静脉区周围界限模糊，比模型组明显的好转（图1-F）。组织病理学结果表明，垂盆草苷对模型组肝脏组织损伤具有一定程度的改善作用，其中高剂量组大鼠肝组织病理改善明显。

3.4 垂盆草苷对MDA、SOD、GSH-Px的影响

如表3所示，与正常组相比，模型组大鼠肝组织匀浆中脂质代谢产物MDA含量明显升高（P＜0.01），抗氧化酶 SOD和 GSH-Px含量显著降低（P＜0.01），说明模型组大鼠出现明显的氧化应激反应。与模型组相比，UDCA组大鼠肝组织匀浆中MDA含量有明显降低（P＜0.01），而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量显著升高（P＜0.01）；垂盆草苷低剂量组大鼠肝组织匀浆中MDA含量下降同时，GSH-Px含量升高（P＜0.05）；而垂盆草苷中、高剂量组大鼠肝组织匀浆中MDA含量明显下降（P＜0.01），而抗氧化酶SOD和GSH-Px含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，垂盆草苷高剂量组降低组织中MDA的效果与UDCA组相似，同时提升组织中抗氧化酶SOD与GSH-Px的活性与UDCA组的效果类似。

Figure 1 Effect of SA on hepatic histopathology inα-naphthylisothiocyanate（ANIT）-induced cholestasis rats（HE，×200）A:Control；B:Model；C:UDCA；D:SA（20 mg／kg）；E:SA（40 mg／kg）；F:SA（80 mg／kg）

Table 3 Effect of SA on malondialdehyde（MDA），superoxide dismutase（SOD）and glutathione peroxidase（GSH-Px）in rats tissue homogenate（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） MDA／（nmol／mg） SOD／（U／mg） GSH-Px／（mg／g ）Control - 0.98±0.09 122.85±14.10 9.60±1.46 Model 80 2.83±0.58** 80.69±7.91** 2.43±0.82**UDCA 100 1.13±0.21＃＃ 118.82±9.38＃＃ 8.87±1.43＃＃SA 20 2.26±0.43＃ 85.09±6.45 4.54±0.86＃40 1.69±0.28＃＃ 99.02±10.94＃ 6.69±1.71＃＃80 1.19±0.24＃＃ 115.39±10.87＃＃ 8.79±1.83＃＃

3.5 垂盆草苷对 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的影响

如表4所示，与正常组相比，模型组大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达明显升高（P＜0.01），说明模型组大鼠出现明显的炎症反应，与模型组相比，UDCA组大鼠血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达明显降低（P＜0.01），垂盆草苷低剂量组大鼠血清中TNF-α与IL-1β表达降低（P＜0.05），；而垂盆草苷中、高剂量组大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达明显降低（P＜0.01）。结果表明，垂盆草苷高剂量组下调炎症因子TNF-α、IFN-γ的表达效果与UDCA组相似，说明垂盆草苷可以降低炎症因子的表达。

Table4 Effect of SA on serum levels of tumor necrosis factor-alpha（TNF-α），interferon-gamma（IFN-γ）and interleukin-1β（IL-1β）in rats（±s，n＝8）

**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

Group Dose／（mg／kg） TNF-α／（pg／mL） IFN-γ／（pg／mL） IL-1β／（pg／mL）Control - 60.69±5.25 25.05±4.50 41.51±6.29 Model 80 208.95±8.85** 116.14±10.72** 195.28±15.16**UDCA 100 90.34±5.41＃＃ 38.34±10.09＃＃ 85.74±9.01＃＃SA 20 198.34±10.71＃ 111.93±8.58 178.19±9.23＃40 135.09±10.54＃＃ 64.33±8.05＃＃ 142.31±8.51＃＃80 94.74±4.66＃＃ 36.59±5.61＃＃ 102.56±12.23＃＃

3.6 垂盆草苷对胆汁酸转运蛋白和合成蛋白的影响

模型组 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表达水平较正常组显著下降（P＜0.01），CYP7A1、CYP27A1蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，垂盆草苷低剂量组SHP-1、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表达水平升高（P＜0.05），垂盆草苷中剂量组 FXR、SHP-1、SHP-2、BSEP、MREP2、NTCP蛋白表达水平升高（P＜0.05，P＜0.01），CYP7A1蛋白表达水平降低（P＜0.05）；垂盆草苷高剂量组 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表达水平显著升高（P＜0.01），CYP7A1、CYP27A1蛋白表达水平显著下降（P＜0.01），且蛋白表达呈剂量依赖性（如图2所示）。实验结果表明，垂盆草苷是通过调控相关蛋白来发挥治疗作用的。

Figure 2 Effect of SA on bile acid transporters and synthetic protein（x¯±s，n＝3）**P＜0.01 vs control group；＃P＜0.05，＃＃P＜0.01 vs model group

4 讨论

肝内胆汁淤积患者主要临床症状为黄疸、尿色深、皮肤瘙痒等［8］，其发病机制为肝细胞中胆汁转运体异常、胆汁调节机制失控［9-10］等。新生儿肝内胆汁淤积症在新生儿中发病率较高，而ANIT是常用的诱导肝内胆汁淤积的模型药物，能够很好地模拟人体肝内胆汁淤积疾病的特点［11］，因此本研究选用ANIT诱导的幼龄肝内胆汁淤积大鼠模型探讨垂盆草苷的保肝机制。

研究表明，ANIT给药造模后，能观察到大鼠胆汁流量减少［12-14］，血清中 AST、ALT、ALP等水平升高，出现明显的炎症反应，在炎症反应中淋巴细胞被激活进入肝脏，从而产生氧化应激现象［15］，同时，ANIT给药造模后，SOD、GSH-Px抗氧化酶显著下降［16］。本研究结果与文献报道一致，ANIT诱导的模型组大鼠胆汁流量明显降低，血清中ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平显著升高，炎症因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达升高，肝组织匀浆中MDA含量增加，而抗氧化酶SOD、GSH-Px含量下降，这些都说明ANIT诱导的胆汁淤积症状有明显的炎症反应和氧化应激现象。

研究发现，FXR核受体是维持胆汁酸肝肠循环和稳态平衡的重要核受体，在胆汁淤积过程中发挥重要作用，可以诱导多种基因的表达，参与调控胆汁酸的新陈代谢，维护体内胆汁酸动态平衡［17-18］。首先是胆汁酸合成，胆汁酸合成有两个途径，中性合成途径是其主要途径，CYP7A1是该途径的关键酶，会通过一系列酶促反应生产胆汁酸，而激活 FXR会激活 SHP受体，从而抑制CYP7A1的表达，达到抑制胆汁酸合成［19］的目的；另外一个途径被称为替代途径，这个途径会产生酸性胆固醇，若胆固醇进入线粒体内会导致胆汁酸合成受到限制，CYP27A1是一种多功能的细胞色素羟化酶，能够催生替代途径的第一步，因此，抑制CYP27A1的表达也会抑制胆汁酸的合成；同时，激活FXR-SHP轴［20］，可以抑制牛磺酸的合成，而牛磺酸在胆汁酸代谢中起着重要的中间作用。另外是胆汁酸转运，FXR可激活胆汁酸外排转运蛋白有胆盐输出泵（BSEP），其激动剂能上调MRP2的表达；同时，激活FXR诱导SHP上调，可调节钠离子牛磺酸共转运多肽（NTCP）对胆汁酸的摄取作用［21］。因此，探讨胆汁酸合成和转运的分子机制是研究胆汁淤积发生发展机制的热点。在本研究结果中，模型组大鼠肝脏组织中的 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表达降低，CYP7A1、CYP27A1蛋白表达升高，这说明ANIT会诱导胆汁酸的合成增加以及降低胆汁酸的转运，这样会导致严重的胆汁淤积现象。

FXR核受体是调节胆汁酸合成、转运的关键受体，这是临床研究胆汁淤积发病机制和临床治疗胆汁淤积的重要参考和方向［22］。但是，目前由于治疗肝内胆汁淤积的药物十分缺乏，通过现代药理学研究分析肝内胆汁淤积病理机制，建立类似的动物模型，是目前去寻找发现治疗药物的常用方法［23］。因此，本研究利用ANIT诱导的幼龄SD大鼠的肝内胆汁淤积模型，以探讨垂盆草苷（SA）ANIT诱导的肝内胆汁淤积大鼠模型的干预和调节作用。研究结果表明，垂盆草苷可显著增加幼龄SD大鼠胆汁流量；降低血清中 ALT、AST、ALP、TBIL、DBIL、TBA水平；降低炎症因子 TNF-α、IFN-γ、IL-1β的表达；显著降低肝脏组织中脂质代谢产物MDA的含量，显著升高抗氧化酶SOD、GSH-Px的含量；改善肝脏组织病理状态，垂盆草苷高剂量组的作用效果与UDCA组类似。同时，通过Western blot法分析胆汁酸转运蛋白与合成蛋白发现，垂盆草苷可上调 FXR、SHP-1、SHP-2、MREP2、BSEP、NTCP蛋白表达，下调 CYP7A1、CYP27A1蛋白表达。因此，本研究结果表明，垂盆草苷可显著改善幼龄SD大鼠胆汁淤积造成的肝脏损伤，对肝内胆汁淤积造成的幼龄SD大鼠肝功能损伤具有干预和调节作用，其作用机制可能与参与胆汁酸的转运与合成有关。