金水宝片对顺铂所致大鼠急性肾损伤的保护作用及机制

刘学武，周志敏，姜德建*，龙 利

（1湖南省药物安全评价研究中心，长沙410331；2新药药效与安全性评价湖南省重点实验室，长沙410331；3湖北省第三人民医院肾病科，武汉430033

药物性肾损伤在临床用药时十分常见，约占急性肾损伤的20%左右。能引起急性肾损伤的药物有很多，常见的有化疗药物、抗生素、非甾体抗炎药（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）、血管紧张素转化酶抑制剂等。临床上发生药物性肾损伤时，通常在停药以及纠正酸碱度的同时，给予肾功能保护药，以加速肾功能的恢复。对已知有肾脏损伤的药物，通常可联合肾功能保护药物一起服用，以减少急性肾损伤的发生和发展。金水宝片主要用于各种病因所致的急性肾脏损伤的预防和治疗［1-2］，其疗效显著，但作用机制不甚明确。本研究采用顺铂诱导大鼠急性肾损伤模型，通过预防和治疗性给予金水宝片，以评价其疗效，并探索金水宝片治疗急性肾损伤的作用机制［3］。

1 材 料

1.1 试 剂

金水宝片（江西济民可信金水宝制药有限公司）；地塞米松片（广东南国药业有限公司）；顺铂注射液（山东仁和堂药业有限公司）；大鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELSIA试剂盒、大鼠活性氧簇（ROS）ELISA试剂盒（武汉贝茵莱生物科技有限公司）；大鼠Caspase 3活性检测试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；Anti-p38抗体、Anti-p-p38抗体、Anti-Bax抗体、Anti-Bcl-2抗体（英国 Abcam公司）；Anti-β-actin抗体（美国 Proteintech公司）。

1.2 仪 器

TP1020型全自动脱水机、ASP300S型全自动组织脱水机、RM2235型石蜡切片机、EG1150H＋C型组织包埋（德国Leica公司）；BX43型生物显微镜＋MD50型数码成像系统（日本奥林巴斯公司）；LABOSPECT003型自动生化分析仪（日本日立公司）；SpectraMax i3x型多功能酶标仪（上海美谷分子仪器有限公司）；164-5050电泳仪（美国Bio-Rad公司）；DYCZ-40A转膜仪（北京六一仪器厂）。

1.3 动 物

SD大鼠144只，SPF级，雄性，（200±20）g，购于湖南斯莱克景达生物技术有限公司，实验动物生产许可证号:SCXK（湘）2016-0002；在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，实验动物使用许可证号:SYXK（湘）2015-0016。所有动物实验均符合动物伦理委员会标准。

2 方 法

分别进行金水宝片预防性给药和治疗性给药实验，其中预防性给药实验采用大剂量的顺铂经腹腔注射诱导急性肾损伤模型；治疗性给药采用小剂量的顺铂经静脉注射诱导急性肾损伤模型。腹腔注射顺铂和静脉注射顺铂分别模拟临床大剂量或小剂量的顺铂进行化疗给药。

2.1 预防性给药对顺铂腹腔注射所致急性肾损伤的作用

雄性SD大鼠66只，按体质量随机分为正常组、模型组、阳性对照组（地塞米松，2 mg／kg）、金水宝片低、中、高剂量组（0.135、0.270、0.540 g／kg），其中正常组6只，其余各组均为12只。各组大鼠按10 mL／kg灌胃给予相应剂量金水宝片（研磨成粉末，用蒸馏水配制成相应浓度的药液），每日1次，连续13 d，正常组、模型组灌胃给予等体积蒸馏水。于给药7 d后，各组大鼠按5 mL／kg一次性腹腔注射顺铂5 mg／kg诱导大鼠急性肾损伤模型，正常组腹腔注射给予等体积0.9%氯化钠注射液。

2.2 治疗性给药对顺铂静脉注射所致急性肾损伤的作用

雄性SD大鼠78只，选用其中72只大鼠作为模型组，并按1 mL／kg经静脉注射顺铂2.5 mg／kg，每日1次，连续5次，诱导大鼠急性肾损伤模型。另取6只雄性大鼠，采用相同方法注射给予等体积0.9%氯化钠注射液，作为正常组。各组大鼠于造模结束后眼眶静脉丛采血，检测肾功能尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平，选取CRE水平最高的大鼠60只，根据血清CRE水平兼顾BUN和体重，随机分为模型组、阳性对照组（地塞米松，2 mg／kg）、金水宝片低、中、高剂量组（0.135、0.270、0.540 g／kg），每组12只。每日给药前将金水宝片（研磨成粉末）用蒸馏水配制成相应浓度药液。各组大鼠均按10 mL／kg灌胃给予相应剂量金水宝片，每日1次，连续9 d，正常组、模型组灌胃给予等体积蒸馏水。

2.3 生理指标检测

2.3.1 对肾功能的影响 预防性给药和治疗性给药实验的各组大鼠分别于造模后各时间点进行眼眶静脉丛采血，检测血清BUN和CRE，以监测肾功能的变化。每次采血前均禁食不禁水6 h，然后眼眶采血约1 mL，3 000 r／min离心10 min，取上层血清，采用自动生化仪检测血清BUN和CRE。于造模第6天采用代谢笼收集各组大鼠6 h尿量，测量排尿量，并用自动生化仪检测尿肌酐水平，并计算肌酐清除率（mL／min）＝尿肌酐×排尿量／（360×血肌酐）。

2.3.2 对肾脏组织病理变化的影响 各组大鼠分别于末次给药后禁食不禁水6 h，CO2麻醉，放血安乐死，取左侧肾脏，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肾脏组织炎症细胞浸润和肾小管上皮细胞变性等病理改变，并进行病理评分，具体评分标准如下:肾小管上皮:正常，完好无损，记“0”分；极少细胞变性坏死，记“1”分；轻度，记“2”分；中度，记“3”分；重度，记“4”分。透明管型:无，记“0”分；极少，记“1”分；轻度，记“2”分；中度，记“3”分；重度，记“4”分。炎细胞浸润:无，记“0”分；极少，记“1”分；轻度，记“2”分；中度，记“3”分；重度，记“4”分。将各类病理改变的评分进行累加，计算总分作为肾脏损伤的整体病理评分。

2.3.3 对细胞因子的影响 各组大鼠分别于末次给药后禁食不禁水6 h，取右侧肾脏0.025 g，用冰预冷PBS洗组织，加入RIPA裂解液200μL于匀浆器中反复研磨至看不见组织块，冰上蛋白裂解10 min，4℃，12 000 r／min离心 15 min，取上清液，采用ELISA试剂盒检测肾脏组织中 TNF-α、ROS的水平和Caspase 3活性。

2.3.4 对肾脏凋亡相关蛋白表达的影响 取左侧肾脏，福尔马林固定，石蜡包埋，切片，HE染色，同时取右侧肾脏0.025 g，用冰预冷PBS洗组织，加入RIPA裂解液200μL于匀浆器中反复研磨组织直至看不见组织块，冰上蛋白裂解10 min，4℃，12 000 r／min离心15 min，将离心后的上清液分装到0.5 mL的离心管中，并进行蛋白定量。分别取总蛋白50μg上样，进行凝胶电泳，半干法转聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以5%的脱脂奶粉封闭1.5 h。用多克隆一抗（兔抗大鼠 t-p38、p-p38、Bax、Bcl-2）与PVDF膜4℃孵育过夜，TBST洗3次，每次15 min。用HRP标记的二抗室温孵育90 min，TBST洗3次，每次15 min，ECL化学发光法曝光扫描拍照，用Quantity One软件分析各组大鼠肾脏中t-p38、pp38、Bax、Bcl-2的蛋白相对表达量，并计算各组中相应蛋白的表达与内参β-actin的相对比值。

2.4 统计方法

本实验数据采用SPSS16.0进行数据统计，计量资料采用±s表示。用Leven′s test方法检验方差齐性。用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行统计分析，用LSD test（参数法）进行两两比较分析。

3 结 果

3.1 对肾功能的影响

3.1.1 对血清BUN的影响 如图1所示，经预防性给药，金水宝片在造模后第3天起效，且持续给药，各给药组BUN在造模后给药第5天达到峰值，其中低剂量组血清BUN在造模后给药第3天较模型组显著降低（P＜0.05），中、高剂量组血清BUN在第3～6天均较模型组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），各组大鼠血清BUN在造模后给药第6天可见恢复趋势。经治疗性给药，金水宝片在造模后给药第5天起效，且持续给药，各给药组BUN在造模后给药第5天达到峰值，其中低、中剂量组血清BUN在造模后给药第7、9天较模型组显著降低（P＜0.05），高剂量组血清BUN在第5～9天均较模型组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），各给药组BUN在造模后给药第7天可见恢复趋势。

Figure 1 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on blood urea nitrogen（BUN）level of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

3.1.2 对血清CRE的影响 如图2所示，经预防性给药，金水宝片在造模后第3天起效，且持续给药，各给药组CRE在造模后给药第5天达到峰值，其中低剂量组血清CRE在造模后各时间点均与模型组无明显差异；中、高剂量组血清CRE在第3～6天均较模型组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），各组大鼠血清CRE在造模后给药第6天可见恢复趋势。经治疗性给药，金水宝片在造模后给药第5天起效，且持续给药，各给药组CRE在造模后给药第5天达到峰值，其中低、中剂量组血清CRE分别在造模后给药第7、9天较模型组显著降低（P＜0.05），高剂量组血清CRE在第5～9天均较模型组显著降低（P＜0.05或P＜0.01），各给药组CRE在造模后给药第7天可见恢复趋势。

Figure 2 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on serum creatinine（CRE）level of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

3.1.3 对肌酐清除率和胱抑素C的影响 如图3所示，与正常组相比，模型组大鼠肌酐清除率显著减小（P＜0.01），血清胱抑素 C水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片预防性给药和治疗性给药后，金水宝片低、中、高剂量组肌酐清除率均显著增加（P＜0.05或P＜0.01），血清胱抑素C水平均显著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

3.2 对肾脏组织的影响

如图4所示，正常组肾脏皮质、髓质结构清晰，肾单位形态结构正常，间质未见炎症细胞浸润。模型组肾脏大量肾小管上皮细胞变性、坏死，并可见纤维化，大量管内可见透明管型，间质可见炎症细胞浸润；经预防性给药或治疗性给药后，金水宝片各剂量组的肾小管变性、坏死以及炎症浸润等程度均较模型组有显著改善，且具有显著的剂量依赖关系，其中预防性给药的起效剂量为低剂量（0.135 g／kg），治疗性给药的起效剂量为中剂量（0.270 g／kg）。

Figure 3 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on creatinine clearance rate（A）and cystatin Clevel（B）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 4 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the changes of renal histopathology of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）A:Prophylactic administration；B:Therapeutic administration；C:Renal histopathology scores1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group

3.3 对肾脏炎症和氧化应激相关因子的影响

如图5所示，与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织中 TNF-α、ROS含量升高（P＜0.05或 P＜0.01）；与模型组比较，金水宝片预防性给药和治疗性给药均能显著降低大鼠急性肾损伤模型肾组织TNF-α和 ROS含量（P＜0.05或 P＜0.01），且其药效作用具有明显的剂量依赖关系。

3.4 对肾脏细胞凋亡蛋白的影响

3.4.1 对肾脏 Caspase 3活性以及 t-p38、p-p38 MAPK蛋白表达的影响 如图6、7所示，与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织Caspase 3活性显著升高（P＜0.05或 P＜0.01），t-p38、p-p38蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，经预防性给药和治疗性给药后，金水宝片低、中、高剂量组Caspase3活性均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），肾脏组织t-p38和p-p38蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01）显著减少，且均具有明显的剂量依赖关系。

3.4.2 对肾脏Bax、Bcl-2蛋白表达以及Bax／Bcl-2比值的影响 如图7、8所示，与正常组比较，模型组肾脏Bax的蛋白表达显著增加（P＜0.01），Bcl-2蛋白表达显著减少（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值显著减小（P＜0.01）；预防性给药和治疗性给药均能显著减少肾脏组织Bax蛋白的表达（P＜0.05或P＜0.01），增加 Bcl-2的蛋白表达（P＜0.01），并显著增大Bcl-2／Bax比值（P＜0.01），且均具有明显剂量依赖关系。

Figure 6 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38（A），p-p38（B）and the activity of Caspase 3（C）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 7 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of Bax（A）、Bcl-2（B）and the ratio of Bcl-2／Bax（C）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 8 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38，p-p38，Bax and Bcl-2 of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x¯±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）

4 讨 论

急性肾损伤是一种以短时间内肾小球滤过率迅速下降为主要特点的临床综合征，是临床常见的危重病症之一，发病后的病死率极高，其病理生理过程较为复杂，主要累及肾脏管状细胞和血管细胞的损害，且伴有明显的炎症反应。本研究分别通过单次大剂量腹腔注射5 mg／kg的顺铂和连续5 d小剂量静脉注射2.0 mg／kg的顺铂诱导大鼠急性肾损伤模型，其中腹腔注射和静脉注射分别与临床腹腔灌注给药和静脉注射给药的方式和剂量接近［4-5］。经两种给药方案造模后，大鼠均表现为典型的急性肾损伤症状，如血清CRE、BUN显著升高，肌酐清除率显著下降，其中单次大剂量造模的大鼠血清CRE和BUN可升高至小剂量造模的3倍左右，胱抑素C水平可升高至小剂量造模的1.2倍左右，肌酐清除率可下降至小剂量造模的20%左右，组织病理学结果也显示了单次大剂量造模能引更严重的急性肾损伤。分别通过对单次大剂量造模大鼠进行预防性给药以及对多次小剂量造模的大鼠进行治疗性给药后发现，虽然单次大剂量造模能引起更严重的急性肾损伤，但预防性给药仍能较好的改善顺铂所致的急性肾损伤，且其疗效较治疗性给药更好，主要表现为血清CRE、BUN指标的起效时间缩短（3 d vs 5 d），且肌酐清除率可恢复到与治疗性给药方式的相当水平，提示在临床应用时，通过提前预防性给药，能较早的干预药物性肾损伤发生和发展。

研究表明，顺铂经肾脏排泄时，可损伤肾小管上皮而产生炎症和氧化等应激反应，并进一步释放炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β等）和氧化产物（ROS）等［6-7］，进而引起速肾脏细胞的变性、凋亡和坏死［8-9］。炎症和氧化应激做为刺激信号，可诱导p38的表达和磷酸化激活［10-11］，磷酸化的 p38（p-p38）可进一步刺激各种细胞因子的分泌［12-13］，同时p-p38还能通过诱导Bax的转位和Bcl-2的表达来调控 Bax、Bcl-2的变化［14］。Bax和 Bcl-2可作为上游信使和下游底物调节Caspase 3的表达。Caspase 3作为细胞凋亡的下游执行者，其高表达能加速细胞凋亡的进程［14-16］。本研究结果显示，金水宝片均能通过抑制肾脏中TNF-α和ROS的含量来达到抗炎和抗氧化的作用，并通过降低t-p38、p-p38和Bax的蛋白表达，升高Bcl-2的蛋白表达来抑制p38 MAPK通路的活化、降低Caspase 3的活性，提示金水宝片对顺铂所致急性肾损伤的保护作用机制可能与其减少 TNF-α，抑制 ROS-p38MAPK-Caspase 3通路来诱导的细胞凋亡有关，且金水宝片预防性给药和治疗性的作用机制基本类似。

综上所述，金水宝片预防性给药和治疗性给药均能显著改善顺铂所致的急性肾损伤模型的肾功能以及肾脏的组织病理变化，提示金水宝片对顺铂诱导的急性肾损伤具有显著防治作用，且其作用机制可能与金水宝片的抑制TNF-α、抑制ROS-p38MAPK-Caspase 3通路，进而抑制细胞凋亡有关。