液相色谱仪检定中的问题及建议

/ 上海市计量测试技术研究院

0 引言

液相色谱仪具有快速、灵敏、高选择、高分离效率及适用范围广等特点，广泛应用于食品药品的定性与定量检测等领域，是分析实验室必备的理化分析测试仪器。随着液相色谱技术的不断发展，仪器的更新换代，液相色谱仪第一版检定规程自1991年01月01日发布实施已经经过两轮修订，能够较好与仪器的发展水平相适应。但是，由于仪器应用面较广，各行业对仪器的性能要求的侧重也不同，本文根据检定实践积累，对规程中泵流量测定、波长示值误差与重复性、线性范围等内容提出方法改进和优化的建议，为规程的修订提供参考。

1 输液系统泵流量实测值的影响因素及其控制

泵流量决定了样品的出峰时间，其设定值误差与稳定性直接影响到样品的定性结果，是仪器检定过程的一个重要环节。规程中泵流量实测值根据收集的流动相的密度、质量以及收集时间由式（1）得到[1]。

式中：Fm—— 流量实测值，mL/min；

W2—— 容量瓶+流动相的质量，g；

W1—— 容量瓶的质量，g；

ρt—— 实验室温度下流动相密度，g/cm3；

t—— 收集流动相的时间，min

实际检定时，通过称重法测量泵流量主要存在以下问题。

1.1 泵流量实测值的影响因素

根据规程，在流动相出口处用事先称重过的洁净容量瓶收集流动相，该出口通常指的是废液端流出口。此时，流动相已经流经整个系统，这不仅是对泵流量的测定，更是对整机流量的测定。其设定值误差与稳定性不仅取决于泵，还会受到其他因素的影响：

1）在常规检定过程中，通常柱温箱为室温状态，但是当检测器为示差折光率检测器时，其柱温须与检测器温度保持一致，为排除室温波动的干扰，通常设定值为35 ℃及以上。此时，以甲醇作为流动相，当甲醇以较高温度的状态流经整个系统后，其挥发速度明显高于室温状态，使得泵流量设定值小于实际值，温度越高，偏离越大。

2）蒸发光检测器是通过洗脱液雾化成气溶胶在漂移管中蒸发，检测蒸汽中样品颗粒的散射光产生的电信号，从而进行数据采集。根据其原理可知，当流动相流经蒸发光检测器后，会产生一定的损耗，并且其废液流出口的管路过粗，可能有部分雾化，呈气雾状，导致从废液端进行流动相收集的结果不准确。在以上情况下，可从检测器入口处采集流动相。但是部分超高效液相色谱仪，其管路粒径小，压力大，流动相会以喷射状流出，若难以准确进行流动相采集，可更换粗粒径管路后进行测量。

3）实验室条件也会对测量结果产生影响，例如部分生产车间不具备最小分度值在1 mg内的天平，或天平不在同层或同楼，或其提供的天平不具有溯源性，均导致测量结果出现偏差。

1.2 泵流量实测值的控制

根据规程，在称重法测量过程中，流动相的采集、称重、计时均是由检定人员手动操作完成，其中不可避免地会引入人为影响因素。同一台液相色谱仪的稳定性由不同的检定人员测量，或者由同一个检定人员先后两次测量，其结果均可能出现较大差异。

为避免人为因素引入的误差，方便用户对液相色谱仪流动相流速的检测，建议可采用商品化液相流量计，直接测量得出泵流量的实测值。该类流量计又称容积式流量计、定排量流量计，属于高精度流量计。其原理是根据收集固定体积流动相所需要的时间，即式（2）计算泵流量。

式中：Fm——流量实测值，mL/min；

V—— 液相流量计的固定体积，mL；

t—— 收集流动相的时间，min

相对而言，液相流量计直接连接于泵端，不受柱温及检测器影响，直接对泵性能进行检测，能更好地减少人为、环境、实验室条件等因素引入的误差，并且在测量过程中操作简便，更具有实用性。对于同一台液相色谱仪，采用液相流量计法和称重法得到的测量结果见表1。根据表中数据可知，液相流量计所测定的泵流量稳定性值优于称重法所得结果，并且由于在后续检定中流量稳定性为必检项目，建议可以在实验室环境因素影响较大的情况下，使用液相流量计测量的方法进行泵流量稳定性的测量。

表1 不同方法测定液相色谱仪泵流量设定值误差和稳定性（室温）

2 进样系统对检测结果影响及检定建议

2.1 样品交叉污染

液相色谱仪在使用过程中进样量小，且样品成分复杂。若进样后残留过高，则会导致样品间的交叉污染，致使数据呈现假阳性，或出现杂峰或干扰峰，影响结果的可信度。而液相色谱仪检定规程中并没有要求对该项目进行检定，无法判断仪器是否对样品引入交叉污染。因此，建议检定规程中增加相应检定项目，具体操作过程可参照2020年2月1日起实施的GB/T 38125-2019《液相色谱仪用自动进样器》。其中在自动进样器样品残留技术指标中，要求空白样与标样的峰面积的比值应不大于0.01%。此外，在该项国家标准中提出的自动进样器的取样体积误差、进样重复性、线性等技术指标都具有极高的参考价值[2]。

2.2 样品室温度

液相色谱仪在理化分析的应用过程中，常用于有机物及生物样品的分析，该类样品对温度较为敏感，在一定温度下可能会引起量变或质变。为了解决这一问题，液相色谱仪在样品室中安装了控温模块，可使样品在进样等待过程中处于低温的状态，得到更好的保存。而液相色谱仪检定规程中并未要求对控温装置的温度准确度进行考核，无法判断样品室温度是否满足需求。鉴于样品室的控温模块并非液相色谱仪必备模块，建议检定规程中根据客户需求，可作为选择项目增加。在具体操作的实施过程中，对不同的指定位置下，样品进样器中恒温器的温度准确性进行考察，其技术指标可参照柱箱温度。

3 检测系统检定结果影响因素及控制

3.1 波长示值误差与重复性

波长示值误差与重复性针对的是液相色谱仪中的紫外-可见光检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器。

液相色谱仪规程中检定紫外-可见光/二极管阵列检测器的常用方法是以泵注入检测器的方式，将重铬酸钾溶液充满整个检测池，测量235 nm，257 nm，313 nm，350 nm处波长示值误差与重复性。荧光检测器是以泵注入检测器的方式，将萘甲醇标准溶液充满整个检测池，测量激发波长290 nm，发射波长330 nm处的波长示值误差与重复性。

液相色谱作为理化分析实验室常用设备，客户的日常使用需求量较大，在检定波长后，由于检测器的检测池中充满高浓度重铬酸钾溶液，导致仪器管路严重污染，需要较长时间的冲洗后才能投入使用。因此，通常可通过各仪器厂商提供的诊断软件对仪器波长进行自检。而对于不具备自检能力的仪器，规程起草人何海红[2]针对该问题提出利用咖啡因乙腈溶液进行液相色谱仪的波长校准，通过进样的方式，测量咖啡因在 205 nm，245 nm，273 nm 处波长示值误差和重复性。该方法普遍应用于各大进口仪器厂商，是被美国FDA承认的波长校准方法，仪器不产生污染，可以减少后处理所用的时间，使仪器能够更快投入使用。

同理，荧光检测器使用萘甲醇标样充满检测池，对标样的需求量较大，建议也采用直接进样的方式，可以较大程度减少萘甲醇的使用量和对样品池的冲洗时间，减少污染，提高工作效率。

除此之外，使用纯水相在0.25 mL/min的低流速下测量水的激发波长350 nm，发射波长397 nm，同样可以得到荧光检测器的波长示值误差和重复性。这也是各仪器厂商荧光波长测定的常用方法。

3.2 线性范围

液相色谱仪的线性范围决定了测量样品的浓度范围，直接影响到样品的定量结果准确性。在液相色谱仪检定规程中，线性范围作为检测器的考察项目，是将标样单独以注射器注射的方式直接注入检测池中，但是，示差折光率检测器对环境、压力、流动相组成有着较高的要求，工作时通常需要保持环境的恒温、恒压，且流动相组成恒定。按照规程进行线性范围检测上限CH检定校准时，以手动方式将注射器中标样推进检测池的过程中，这三者都会发生明显变化，无法保证测得结果的准确性。李硕等[4]在2014版液相色谱仪检定规程发布后提出利用改进进样方式，提高线性范围检定的可操作性。本实验室采用自动进样器的方式进样（甲醇中胆固醇溶液：胆固醇含量 1×10-4～10×10-4g/mL），所得结果与同一台仪器注射法进样结果见表2。

表2 不同进样方法测定液相色谱仪泵流量设定值误差和稳定性

由表2中数据可知：利用自动进样器直接进样的方式能够呈现出更好的线性关系，该方法能综合评价包括进样器在内的整机线性范围性能。手动注射的方式会在样品注入检测器的瞬间产生较为显著的温度、压力、流动相组成的变化，对于示差折光率检测器的干扰过大，存在着不稳定性因素，所得结果的重现性差。

在常规检定及日常使用过程中，通常以有机相作为流动相使用。因此，为更好地考察仪器整机的线性性能，可以在纯甲醇相中，通过自动进样器进样方式考察线性。其中，紫外-可见检测器、二极管阵列检测器、荧光检测器均可使用萘甲醇标样进样，示差折光率检测器可使用胆固醇-甲醇标样进样。若仪器日常以水相作为常用流动相，则可在不接色谱柱的情况下，使用丙酮-水溶液进样，得到线性结果。陈敏等[5]针对紫外检测器线性范围的检定，也同样提出了自动进样器进样的方式，减少样品消耗量，缩短检定时间，证明了自动进样器进样方式在紫外检测器上同样具有可行性。

4 结语

本文根据检定经验和试验数据，针对液相色谱仪检定涉及的泵流量测定、波长示值误差与重复性、线性范围等的方法进行探讨。对泵流量测定提出可以增加液相流量计法，提高工作效率。对波长示值误差与重复性提出咖啡因进样方式，避免仪器污染。对线性范围测定，以实验数据证明对于温度、压力、流动相组成的变化敏感的示差折光率检测器而言，自动进样器进样方式更具有可操作性。同时结合液相色谱仪工作实际，提出可以增加样品交叉污染、样品室温度性能的检定，为更加完整地评价仪器性能提供参考。