草珊瑚种子离体培养研究初探

付燕?万新屏

摘要 以草珊瑚种子作为外植体，研究了赤霉素和NaOH浸种、升汞处理时间长短、不同培养基和植物生长调节剂对草珊瑚种子离体培养的影响。结果表明：0.02%赤霉素浸种24 h不仅可以提高草珊瑚种子萌芽率，还可以缩短萌发时间;采用0.1%升汞处理种子3 min，种子的污染率仅1.17%;草珊瑚种子初代培养的最佳培养基为1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂，萌芽率达78.87%;最佳增殖培养基为MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+5 g/L琼脂，丛生芽诱导率达82.96%。

关键词 草珊瑚;种子;离体培养;赤霉素;植物生长调节剂

中图分类号：R282.1 文献标识码：A 文章编号：2095–3305（2020）08–0–02

Abstract Seeds were used as explants to study the effects of the immersion of GA3 and NaOH， the duration of mercury-rising treatment， different media and plant growth regulator on the in vitro culture of  Sarcandra glabra.The results showed that immersion 24 hours with 0.02% GA3 could not only improve seed germination rate， but also shorten germination time;The contamination rate of seeds was only 1.17% with 0.1% HgCl2 treatment for 3min;The best culture medium for the primary culture of seed was 1/4 MS +0.5 mg/L 6-BA + 0.05 mg/L NAA + 30g/L sucrose + 5g/L agarophyte， the germination rate was 78.87%;The best medium for proliferation was MS + 4.0mg/L 6-BA + 0.5mg/L NAA+30g/L sucrose+5g/L agarophyte， and The induced rate of fascicled shoots reached 82.96%.

Key word Seeds; Sarcandra glabra; In vitro culture; GA3; Plant growth regulator

DOI：10.19383/j.cnki.nyzhyj.2020.08.009

草珊瑚（Sarcandra glabra （Thunb.）Nakai）是金粟兰科，属多年生常绿草本，主要分布于中国安徽、浙江、江西、福建、四川、贵州、云南等地。草珊瑚株供药用，能清热解毒、祛风活血、消肿止痛、抗菌消炎[1]。随着草珊瑚药用价值的不断开发，目前草珊瑚已逐渐由挖掘野生资源转为人工种植，但种苗繁育技术一直是限制草珊瑚大面积种植的因子[2]。目前生产中主要采用种子育苗和扦插育苗两种方式繁育种苗，繁殖系数较低。通过植物组培快繁技术，能极大地提高育苗系数，满足生产用苗所需。以成熟的草珊瑚种子为外植体，以清水为对照，比较赤霉素和NaOH浸种对种子萌发效果的影响，同时通过对培养基和植物生长调节剂的筛选，研究草珊瑚离体再生体系，为生产中草珊瑚种苗繁育提供技术支撑。

1 材料与方法

（1）草珊瑚成熟果实采至天柱县林下野生草珊瑚植株，采集后去掉果肉，清水冲洗干净，放阴凉通风处备用。

（2）外植体的处理。接种之前，外植体用0.02%的赤霉素溶液浸泡24 h和0.5 mol/L NaOH溶液浸泡处理24 h，以清水为对照，浸泡后除去漂浮种子，流水冲洗10 min，接种到1/4 MS+0.5

mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，比较赤霉素和NaOH浸种对种子萌发的影响。

在超净工作台上，先用75%的酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～4次，分别用0.1%升汞浸泡3 min、5 min和7 min，浸泡过程中不停振荡液体，再用无菌水冲洗3～4次。比较0.1%升汞不同处理时长对种子污染和萌发率的影响。

处理后的种子分别接种到三种初代培养基上：MS+0.5 mg/L 6-BA、1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA、1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA、1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA+

0.05 mg/L NAA。每瓶接种3颗种子，每个处理30瓶。观察并统计各培养基中外植体诱导分化出芽的情况。

发芽率（%）=（萌芽种子数/接种种子总数）×100%;

污染率（%）=（污染种子数/接种种子总数）×100%;

褐化率（%）=（褐化种子数/接种种子总数）×100%。

（3）种子萌芽后，将芽转移到增殖培养基上进行增殖培养。增殖培养基为：MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA、MS+3.0 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA、MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA。每個处理接种30个芽，试验重复3次。

（3）培养条件。所有培养基附加30 g/L蔗糖和5 g/L的琼脂，培养条件为25℃，每天光照12 h，光照强度1 500～2 000 lx。

（5）数据分析。试验数据用spss19.0软件进行统计分析，并用Duncan't法作显著性差异分析。

2 结果与分析

2.1 升汞不同处理时长对种子污染率和萌发率的影响

用0.1%的升汞处理草珊瑚种子，不同处理时长对种子的萌发有一定的影响。处理3 min、5 min和7 mim，种子的污染率都较低，各处理间比较没有显著差异，发芽率升汞处理3 min显著高于5 min和7 min，但种子褐化率随处理时间延长而显著增加（表1）。因此，综合考虑，草珊瑚种子外植体灭菌处理可采用0.1%升汞处理3 min。

2.2 赤霉素和NaOH浸种对草珊瑚种子萌芽效果的影响

经过0.02%赤霉素和0.5 mol/L NaOH浸种处理的种子在萌发时间和萌发率上都有显著差异。0.02%赤霉素处理的种子萌发时间最短，接种后25 d左右开始膨大，然后种子逐渐出现绿色，35 d左右突破种皮，逐渐萌发;0.5 mol/L NaOH处理的种子萌发稍晚于赤霉素处理的种子，30 d左右膨大，40 d左右种子开始逐渐萌发;清水处理35 d左右开始膨大，逐渐出现绿色，45 d左右突破种皮，逐渐萌发。接种后60 d统计发芽率，发芽率最高的为赤霉素处理的种子，发芽率≥78.87%，其次为NaOH处理的种子，达67.67%，清水浸种处理萌发率最低（表2）。因此，在后期研究中，草珊瑚种子外植体处理程序为：先用0.02%赤霉素溶液浸种处理24 h，然后在超净工作台上用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗3～4次，再用0.1%升汞浸泡3 min，接种到初代培养基上。

2.3 培养基成分对草珊瑚种子萌发的影响

基本培养基对草珊瑚种子的发芽率和幼苗生长状况具有显著影响。基本培养基为MS时，种子萌芽率最低，苗较矮、节间短。随着培养基中无机盐浓度降低，草珊瑚种子的萌芽率逐渐提高，其中1/4 MS培养基种子萌芽率最高。植物生长调节剂需要配合使用6-BA与低浓度NAA，种子萌芽率最高，为78.89%，幼苗生长健壮。单独使用6-BA诱导效果不及与NAA配合使用效果理想，且培养基中只添加6-BA时，胚根在生长过程中出现异常膨大，幼苗节间缩短。通过筛选，草珊瑚种子初代培养最佳培养基为1/4 MS+0.5 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA（表3）。

2.4 不同植物生长调节剂对草珊瑚组培苗增殖效果的影响

将萌发后的草珊瑚种苗去掉胚根，分别接种到5种增殖培养基中。草珊瑚增殖比较缓慢，5种培养基中的草珊瑚顶芽均在接种后25 d左右开始萌发侧芽，40 d左右从基部逐渐萌发出丛生芽，60 d左右逐渐形成丛生苗。不同浓度的6-BA和NAA配比对草珊瑚丛生芽增殖效果存在显著差异，随着6-BA浓度逐渐升高，诱导率也逐渐升高，苗节间逐渐变长;而NAA浓度相对较高时，芽生长的同时基部萌发根系或出现愈伤组织，诱导率不理想，其中5号处理MS +4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA诱导效果最好，丛生芽数量多，苗生长健壮（表4）。

3 讨论

草珊瑚为一种广谱性中药材，使用范围广，随着开发利用的不断扩展，需求量急增;而在开发过程中，很多药农却忽视了对资源的保护，在采集时图方便，往往是连根拔起，致使野生资源遭受毁灭性的破坏，造成原料药材供应紧张。而传统的播种出苗慢，繁殖系数低，周期长，存在苗木参差不齐的现象，影响了栽培的成活率[3]。本研究采用种子为外植体进行草珊瑚组培育苗，在接种种子前，采用赤霉素浸种24 h处理，不仅可以使种子充分吸水，还可以打破种子的休眠，使种子提早萌发，提高发芽率[4]。虽然使用NaOH也能缩短种子萌发时间，但效果不及赤霉素效果理想。

在组织培养中，培养基的种类和植物生长调节剂都对培养材料的生长有重要影响。在本研究中，由种子作外植体的初代培养中，1/4 MS培养基对种子的萌发最为有利，而低浓度6-BA和NAA配合使用能显著提高萌芽率。在增殖培养中，增殖效果最好的是MS+4.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA，增殖效果好，可促进苗生长健壮。本研究还发现，用草珊瑚种子作外植体，种子萌发需要的时间比较长，在增殖过程中，需要的增殖周期也较一般草本植物长，这与黎颖菁等[5]的研究结果一致。因此，需要在后期研究中进一步调整培养基配方，缩短增殖周期，达到大量增殖的效果。

参考文献

[1] 黎颖菁.草珊瑚的组织培养与植株再生研究[D].南宁：广西农业大学，2008.

[2] 朱淑颖，杨帆，姜叶琴，等.草珊瑚的无菌播种和丛生芽诱导研究[J].种子，2016，35（8）：32–36.

[3] 覃文学.林下套种草珊瑚栽培技术[J].现代农业科技，2019（9）：64–65.

[4] 張益锋，何平，胡世俊，等.草珊瑚种子萌发特性研究[J].中国中药杂志，2009，34（22）：2950–2957.

[5] 黎颖菁，蓝祖栽，凌征柱.草珊瑚的组织培养及植株再生研究[J].食品与药品，2008，10（1）：32–34.

责任编辑：黄艳飞