壮骨舒筋丸药品质量标准研究

2020-05-11杨丁懿张永萍杨芳芳

云南中医中药杂志 2020年2期

杨丁懿张永萍杨芳芳

摘要：目的建立壮骨舒筋丸（白芍、白術、骨碎补、淫羊藿、党参等二十余味药材）的质量标准。方法 TCL法鉴定白芍、白术、骨碎补、川续断皂苷VI、淫羊藿苷。HPLC法测定芍药苷含量。结果 TCL斑点清晰，重复性好。芍药苷在9.15～228.75μg/mL范围内线性良好，平均加样回收率为99%（RSD=2.03%）。结论该方法可行，重复性好，可用于壮骨舒筋丸的质量控制。

关键词：壮骨舒筋丸;TCL;HPLC;白芍;白术;骨碎补;川续断皂苷VI;淫羊藿;芍药苷

中图分类号：R927.11 文献标志码：A 文章编号：1007-2349（2020）02-0078-07

舒筋壮骨丸为贵州省遵义红花岗刘端方骨科医院的经验方，由党参、白术、白芍、当归、熟地黄、海马、鹿茸、淫羊藿、杜仲、续断等20余位味中药制成的浓缩丸，气香、味微苦。具有补气血、养心脾、补肝肾、强筋骨，祛风湿、通经络的功效。治疗骨折后期，已近愈合，肝脾肾虚弱证。该方成分复杂多样，为保证临床用药安全有效，故需要建立统一的质量标准。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-A20高效液相色谱仪器（日本岛津公司）;郁金香C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;JM-B2003电子天平（诸暨市超泽衡器有限公司）;恒温水浴锅（上海双捷实验设备有限公司，批号：DRHH-S4）;SB-4200D超声波清洗仪（宁波新艺超声设备有限公司，批号：18-005016）;ZF-1型三用紫外线分析仪（上海金鹏分析仪器有限公司）;点样毛细管（规格：0.3x100 上海长城科学仪器商店经销）

1.2 试药骨碎补对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121169-201304）、川续断皂苷VI对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111685-201707）、白术对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120925-201611）、淫羊藿对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：121632-201502）、白芍对照药材（中国食品药品检定研究院，批号：120905-201109）;芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，批号：111685-201734）;高效板G薄层板、硅胶G薄层板（规格：50×100mm、100×200mm 青岛海洋化工厂分厂）;结晶氯化铝（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：Q/12HB4249-2009）、硅胶GF254薄层板（规格：100×200mm 青岛海洋化工有限公司制造）、香草醛（天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：Q/12HB3637-2010）、乙腈为色谱级（国药集团化学试剂有限公司），高液用水均为哇哈哈矿泉水，其他试剂均为分析纯（天津市富宇精细化工有限公司）。舒筋壮骨丸由贵州中医药大学药剂实验室提供。

2 方法与结果

2.1 HPLC含量测定

2.1.1 色谱条件乙腈-水（12：88）;检测波长：230 nm;流速：1.0 mL/min;柱温：30℃。

2.1.2 供试品溶液制备工艺考察：

2.1.2.1 提取方法考察取本品，混匀，研细，取1 g，精密称定，置于50 mL锥形瓶中，移液管精密吸取30 mL甲醇，分别进行回流处理30 min和超声处理30 min，放冷后补重，吸取溶液过微孔滤膜即为供试品。将供试品分别注入高效液相色谱仪，考察不同提取方法提取样品中芍药苷含量的影响，结果见表1。

2.1.2.2 提取溶剂考察取本品，混匀，研细，取1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，用移液管精密吸取甲醇30 mL与乙醇30 mL作为溶剂采用超声法处理30 min，放冷后补重，吸取样品溶液过微孔滤膜即为供试品。将供试品分别注入高效液相色谱仪，考察不同提取溶剂提取对样品中芍药苷含量的影响，结果见表2。

2.1.2.3 提取时间考察取本品，混匀，研细，取1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，用移液管精密吸取甲醇30 mL作为提取溶剂，分别超声处理15 min，30 min，45 min，放冷后补重，吸取样品溶液过微孔滤膜即为供试品。将供试品分别注入高效液相色谱仪，考察不同提取时间对样品中芍药苷含量的影响，结果见表3。

2.1.2.4 提取溶剂用量考察取本品，混匀，研细，取1 g，精密称定，置于50 mL量瓶中，用移液管分别精密吸取10 mL，20 mL，30 mL甲醇，超声处理15 min，放冷后补重，吸取样品溶液过微孔滤膜即为供试品。将供试品分别注入高效液相色谱仪，考察不同提取溶剂用量对样品中芍药苷的影响，结果见表4。

2.1.2.5 供试品溶液的制备综上所述，为了减少细小颗粒对于有效成分的吸附，便于其提取与溶出，供试品溶液的制备方法为：取壮骨舒筋丸研细混匀，精密称取本品1 g，置于50 mL锥形瓶中，用移液管精密吸取20 mL甲醇，称定重量，超声15 min，放冷后用甲醇补足损失的重量，过微孔滤膜，即得。

2.1.3 阴性供试品溶液的制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除白芍，再按照相关制备工艺制成不含白芍的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.1.2.5”项下的制备方法制备成阴性供试品溶液。

2.1.4 对照品溶液的配制用十万分之一天平精密称取芍药苷对照品0.68 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇至对照品完全溶解，即得每1 mL含68 μg的对照品溶液。

2.1.5 专属性考察按照《中国药典》2015年版白芍含量测定项下芍药苷测定方法，检测波长为230nm，对照品、供试品、阴性供试品溶液均在“2.1.1”色谱条件下进样，色谱图见下图1。

2.1.6 线性关系考察精密称取芍药苷18.30 mg，溶于20 mL甲醇，将对照品配置成0.915 mg/mL。用移液管分别精密吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、2.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液定容至10 mL。在“2.1.1”色谱条件下进样10μl进行高效液相色谱测定。以溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，得方程为y =12477x-8856.4（R=0.999），故在9.15～228.75 μg/mL 范围内线性良好。

2.1.7 精密度实验在“2.1.1”色譜条件下精密吸取对照品溶液（68 ug/mL）进样10 μL进行高效液相色谱测定。根据实验结果分析测得芍药苷峰面积RSD为0.63%，说明仪器精稳定，密度良好。

2.1.8 稳定性实验按“2.1.2.5”项下供试品制备方法制备供试品溶液，在不同时段进行测定（0，2，4，6，8，10，12，16，24小时），按“2.1.1”色谱条件下进样10μl进行高效液相色谱测定。根据实验结果分析测得芍药苷峰面积RSD为0.71%，表明样品溶液在24小时内稳定性良好。

2.1.9 重复性实验按“2.1.2.5”项下供试品制备方法制备供试品溶液六份，在“2.1.1”色谱条件下进样10μl对六份样品进行测定。测得芍药苷含有量RSD为2.48%。

2.1.10 加样回收率实验精密称取六份芍药苷含量已知的（1.56 mg/g）本品，精密称取，每份0.5 g，用移液枪精确吸取对照品（0.915 mg/mL）857μl加入六份样品中，按照“2.1.2.5”项下供试品制备方法制备供试品溶液，在“2.1.1”色谱条件下进样10μl进行高效液相色谱测定，结果见表5。

2.2 TLC定性鉴别

2.2.1 续断的TCL鉴别

2.2.1.1 供试品的制备[1] 取本品适量，研细，取5 g，加水50 mL，超声30 min，过滤，取滤液10 mL，加用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，用氨试液（40 mL浓氨加水到100 mL）10 mL萃取1次，用正丁醇饱和的水10 mL萃取一次，均取上层澄明溶液，萃取液蒸干，之后加1 mL甲醇使其慢慢溶解，即得供试品溶液。

2.2.1.2 对照品的制备[2] 用十万分之一天平精密称取川续断皂苷VI对照品0.56 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇至对照品完全溶解，即得每1 mL含56 μg的对照品溶液。

2.2.1.3 阴性样品溶液的制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除续断，再按照相关制备工艺制成不含续断的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.1.1.1”项下壮骨舒筋丸供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.1.4 试验方法与结果根据《中国药典》2015版第四部通则0502薄层色谱试验[2]，采用毛细管点样器吸取“2.1.1.1”“2.1.1.3”项下溶液5μL，“2.1.1.2”项下溶液2μL，分别点于同一硅胶G板上，正丁醇：醋酸：水（4：1：5）上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液置于105℃下加热至斑点显色清晰[3]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上都显紫色斑点，而续断阴性对照溶液在相应位置处无干扰。见图2。

2.2.2 白芍的TCL鉴别

2.2.2.1 供试品溶液的制备[2] 取本品适量，研细，取5 g，加水50 mL，超声30 min，过滤，取滤液10 mL，加用水饱和的正丁醇萃取2次，每次10 mL，合并萃取液，用氨试液（40 mL浓氨加水到100 mL）2.5 mL萃取1次，用正丁醇饱和的水7.5 mL萃取1次，均取上层溶液，取萃取液蒸干，加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。2.2.2.2对照药材溶液的制备：称取0.5 g白芍对照药材，用“2.2.2.1”项下同样方法制得。

2.2.2.3 白芍阴性溶液的制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除白芍，再按照相关制备工艺制成不含白芍的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.2.2.1”项下壮骨舒筋丸供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.2.4 试验方法与结果根据《中国药典》2015版第四部通则0502薄层色谱试验，采用毛细管点样器吸取“2.2.2.1”“2.2.2.3”项下溶液4μL，“2.2.2.2”项下溶液2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：乙酸乙酯：甲醇：浓氨（8：1：4：1）溶液[4]为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸乙醇溶液置于105℃下加热至斑点显色清晰[2]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上都显蓝紫色斑点，而白芍阴性对照溶液在相应位置处无干扰。见图3。

2.2.3 白术的TCL鉴别

2.2.3.1 供试品溶液的制备[5] 取本品适量，研细，取5 g，加乙醚50 mL，超声30 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。

2.2.3.2 对照药材溶液的制备称取白术对照药材0.5 g，按“2.2.3.1”项下同法制成对照药材溶液。

2.2.3.3 阴性样品溶液制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除白术、苍术（含有特定成分苍术酮[6]）再按照相关制备工艺制成不含白术、苍术的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.2.3.1”项下壮骨舒筋丸供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.3.4 试验方法与结果根据《中国药典》2015版第四部通则0502薄层色谱试验，采用毛细管点样器吸取“2.2.3.1”“2.2.3.3”项下溶液7μL，“2.2.3.2”项下溶液4μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚：乙酸乙酯（3：1）溶液为展开剂展开，取出，晾干，置紫外灯（254nm）下观察[7]。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上都显暗斑，而白术阴性样品色谱在相应位置处无相同显示。且无干扰，分离效果、重现性均好。见图4。

2.2.4 淫羊藿的TCL鉴别

2.2.4.1 供试品溶液的制备[8] 取本品适量，研细，取5 g，加水50 mL，超声30 min，过滤，取滤液10 mL，加用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并萃取液，用氨试液（40 mL浓氨加水到100 mL）10 mL萃取2次，用正丁醇饱和的水10 mL萃取3次，蒸干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液。

2.2.4.2 对照药材溶液的制备称取0.5 g淫羊藿对照药材，用“2.2.4.1”项下同样方法制得。

2.2.4.3 阴性样品溶液的制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除淫羊藿，再按照相关制备工艺制成不含淫羊藿的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.2.4.1”项下壮骨舒筋丸供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.4.4 试验方法与结果根据《中国药典》2015版第四部通则0502薄层色谱试验，采用毛细管点样器吸取“2.2.4.1”“2.2.4.3”项下溶液8μL，“2.2.4.2”项下溶液3μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷：甲醇：水（13：7：2）下层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液置于105℃下加热至斑点显色清晰。在对照品色谱显示色斑的相应位置上，供试品色谱显示相同颜色的淡黄色斑点，而阴性样品色谱在同样位置上无相同显示，且干扰较小，分离效果。重现性均好。见图5。

2.2.5 骨碎补的TCL鉴别

2.5.5.1 供试品溶液的制备[9] 取本品适量，研细，取5 g，加水50 mL，超声处理30 min，过滤，取滤液10 mL，用乙酸乙酯20 mL萃取1次，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解。即得供试品溶液。

2.5.5.2 对照药材溶液的制备取对照药材0.5 g，按“2.5.5.1”项下同法制得对照药材溶液。

2.5.5.3 阴性样品溶液的制备按壮骨舒筋丸处方称取方中药材，剔除骨碎补，再按照相关制备工艺制成不含骨碎补的“壮骨舒筋丸”即为阴性样品，再按“2.5.5.1”项下壮骨舒筋丸供试品溶液的制备方法制备阴性样品溶液。

2.2.5.4 试验方法与结果根据《中国药典》2015版第四部通则0502薄层色谱试验，采用毛细管点样器吸取“2.2.5.1”“2.2.5.3”项下溶液7μL，“2.2.5.2”项下溶液1μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯：乙酸乙酯：甲酸：水（1：12：2.5：3）上层溶液为展开剂展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铝乙醇溶液，晾干，置于紫外灯（365nm）下检视。在对照品色谱显示色斑的相应位置上，供试品色谱显示两个相同颜色的黄绿色斑点，而阴性样品色谱在同样位置上无相同显示，且干扰较小，分离效果。重现性均好。见图6。

3 讨论

本研究的处方药味多，研究干扰多，难度较大。而本实验在测定芍药苷含量时，考察了多种流动相，如水-甲醇，0.1%磷酸水-乙腈，但由于此药方中药味多达20多种，成分多样且复杂，导致了上述的流动相检测出来的芍药苷均有各种问题，如分离度达不到，基线不平稳等，而采用水-乙腈（88：12）则检测芍药苷能达到标准，故采用此方法测芍药苷。

在对白术进行薄层鉴别时，通关查阅相关资料，发现该处方中的苍术也含有苍术酮，故在做双阴性鉴别。白术含有苍术酮，又因本品处方中苍术也含有苍术酮，所以做成双阴性试验，在展开系统石油醚：乙酸乙酯（50：1）[2]条件下，薄层板上呈现红色斑点，由于显色剂是香草醛，背景颜色太深致使桃红色斑点颜色不清晰，故舍弃。于是查阅资料讲展开系统换成氯仿：丙酮（19：1）[9]和环己烷：乙酸乙酯：乙醚（1：1：1）[10]均出现斑点颜色淡不清晰的情况。

在实验点样的过程中，分别考察了5μL、7μL、10μL三个点样量，色谱图显示点样量为10μL时主斑点有拖尾现象，而为5μL时主斑点颜色淡看不清，所以选择7μL作为最佳点样量。

4 结论

壮骨舒筋丸药味多，不管是进行高效液相色谱检测还是薄层鉴定法干扰都极大，而本实验则建立了壮骨舒筋丸的质量标准，该法准确性高，有着良好的重复性，可为该制剂的质量控制提供可靠的参考依据。

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