类风湿关节炎大鼠滑膜细胞凋亡基因调控的实验研究

周文旭 谭湘淑 佘君

摘要：目的  觀察甲氨蝶呤（MTX）对类风湿关节炎（RA）大鼠滑膜细胞凋亡及细胞凋亡调控基因的影响，探讨MTX的作用机制。方法  选择SPF级雌性健康SD大鼠40只，每只大鼠尾根部皮下多点注射Ⅱ型胶原蛋白0.2 mg，造模后l0 d将动物随机分为假模型组、模型组，高（30 mg/kg）、中（3 mg/kg）、低（0.3 mg/kg）给药组，各8只。给药组每组按10 ml/kg MTX灌胃，假模型组、模型组给予等量生理盐水灌胃。分离培养大鼠膝关节滑膜组织，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，WB技术检测Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白表达情况。结果  高、中、低剂量给药组抑制大鼠足肿胀的作用均优于模型组（P<0.05），且呈剂量依赖性;各组均能不同程度诱导RA滑膜细胞凋亡，高剂量给药组与模型组及假模型组比较，诱导RA滑膜细胞凋亡更明显（P<0.05）;高剂量给药组Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达量与模型组比较明显上调，Bc1-2蛋白表达量下降（P<0.05）。结论  MTX诱导风湿性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡，其机制可能与下调Bcl-2表达，上调Caspase-3、Caspase-9与Bax表达有关。

关键词：关节炎，类风湿;甲氨蝶呤;细胞凋亡;滑膜;大鼠;Bcl-2;Caspase-3

中图分类号：R593.22                                文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.021

文章编号：1006-1959（2020）05-0071-03

Abstract：Objective  To observe the effects of methotrexate （MTX） on the apoptosis of synovial cells and apoptosis-regulating genes in rats with rheumatoid arthritis （RA）， and to explore the mechanism of action of MTX. Methods  40 SPF female healthy SD rats were selected. Each rat was injected subcutaneously with 0.2mg of type Ⅱ collagen at the subcutaneous point.On the 10th d after modeling， the animals were randomly divided into a sham model group， a model group， a high （30 mg/kg）， a medium （3 mg/kg）， and a low （0.3 mg/kg） administration group.Each group consisted of 8 rats. Each dose group was administrated with 10 ml/kg MTX. The sham model group and model group were given the same amount of normal saline. The knee synovial tissue of rats was isolated and cultured， and the apoptosis rate was detected by flow cytometry， and the expression of Caspase-3， Caspase-9， Bax， Bcl-2 was detected by WB technology. Results  The high， medium and low dose groups were better than the model group in inhibiting the swelling of the rats' feet，the difference was statistically significant （P<0.05） and was dose-dependent; each group could induce RA synovial cells to varying degrees Apoptosis， compared with the model group and the pseudo-model group， the high-dose administration group induced apoptosis of RA synovial cells more significantly （P<0.05）; the high-dose administration group expressed Caspase-3， Caspase-9， and Bax proteins with The model group was significantly up-regulated， and the expression of Bc1-2 protein decreased （P<0.05）. Conclusion  MTX induces apoptosis of synovial cells in rheumatoid arthritis rats. The mechanism may be related to down-regulating Bcl-2 expression， up-regulating Caspase-3， Caspase-9 and Bax expression.

Key words：Arthritis， rheumatoid;Methotrexate;Apoptosis;Synovial membrane;Rat;Bcl-2;Caspase-3

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种临床常见的以侵犯关节滑膜、软骨及骨为主的自身免疫病，其发病机制复杂，病变过程涉及多种细胞和细胞因子，位于关节滑膜内层的成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocytes，FLS）在RA病变中异常活化，是介导关节局部炎症的关键细胞之一。研究表明[1]，RA的关节软骨和骨组织损害，与滑膜细胞的过度增生活化与凋亡不足密切相关。因此，抑制炎性滑膜组织增生及诱导滑膜组织中各种细胞凋亡是类风湿性关节炎治疗的靶点[2，3]。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是传统的改善病情抗风湿药（DMARDs），近20多年来已成为RA临床治疗的基石用药（Anchor drug）[4]，但其治疗RA的作用机制尚不明确。本研究采用CIA模型，观察MTX对大鼠整体疗效及对滑膜组织中Bcl-2、Bax、caspase-3、9蛋白的表达影响，探讨MTX治疗RA的作用机制，以期为寻找新的抗RA药物提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物  本实验方案已通过西安交通大学医学院动物实验伦理审查委员会审查同意，审批许可号为XJMU2018032。SPF级雌性健康SD大鼠40只，体重50～100 g，体重（120±20 g），鼠龄4～5周，中国医学科学院生物制品研究所提供。实验开始前     1周进行适应性饲养，保持室内22℃，自由摄食。

1.2药品与试剂  酸可溶性Ⅱ型胶原蛋白（CⅡ）与弗氏不完全佐剂为Sigma公司产品，MTX片（通化茂祥制药有限公司，国药准字H22022674，规格：2.5 mg×100片），Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體及辣根过氧化物酶标记山羊抗大鼠IgG购自碧云天生物技术有限公司。Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自美国Thermo公司;荧光定量试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司。引物由Invitrogen公司合成。药物均研磨成粉末，用生理盐水制成所需浓度。

1.3方法

1.3.1动物造模与分组  选取SPF级雌性健康SD大鼠40只，用0.l mmol/L醋酸溶解Ⅱ型胶原蛋白    （2 mg/ml，4℃，过夜），再与等量弗氏完全佐剂混合，于冰浴中充分乳化，除正常组外每只大鼠尾根部皮下多点注射胶原蛋白0.2 mg。造模后10 d将动物随机分为假模型组、模型组，高、中、低给药组，各8只。各组给药（MTX）量如下：高剂量给药组30 mg/kg，中剂量给药组3 mg/kg，低剂量给药组0.3 mg/kg，按10 ml/kg量灌胃，1次/d。假模型组、模型组给予等量生理盐水灌胃，1.0 g/kg，1次/d。各组给药频次按照药物的临床用药规格，连续用药30 d。分别于致炎后第14、16、18、20、24、28天用毛细管放大测量法测右后足体积，求出肿胀增长百分率=[（给药后值-给药前值）/给药前值]×100%。分别于造模前、造模后每天观察大鼠体毛的色泽改变、神志及活动状态、局部炎症红肿及全身迟发性变态反应等，并每周测1次体重。

1.3.2滑膜细胞分离培养  各组大鼠末次给药后24 h，无菌操作取大鼠膝关节滑膜组织，剪成1 mm3大小后加4 m1 0.4 mg/ml的Ⅱ型胶原酶（溶于含10%胎牛血清的DMEM培养基），于5% CO2条件下孵育3 h，离心收集未贴壁的细胞，将细胞重悬于含有15%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM培养基，置37℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。实验用第2～4代细胞。实验时用含15%小牛血清的DMEM培养液将滑膜细胞数调整至1×106个/ml细胞加入6孔培养板内，每孔2 ml，于37℃、5%CO2培养箱培养4 h。

1.3.3流式细胞术检测细胞凋亡率  取对数生长期细胞，按细胞浓度为2×105/ml，每孔接种1 ml于6孔培养板。培养24 h后，吸弃残余培养基，根据动物造模结果选取大鼠足肿胀抑制作用最有效的药物浓度组（3 mg/kg MTX），与未给药的模型组共3个组。继续培养24 h后吸弃上清液，PBS洗涤2次，胰酶消化收集细胞，重悬于离心管中，室温下2000 r/min离心5 min。用Loading Buffer悬浮细胞，制备细胞悬液，向悬液中加入5 μl AnnexinV FITC和10 μl碘化丙啶（PI），混匀。室温避光孵育5 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率，重复3次。

1.3.4 Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表达测定  提取细胞总蛋白，然后取蛋白质样品50 μg加上样缓冲液煮沸变性后，进行10% SDS PAGE;电转移至PVDF膜;用含5%脱脂奶粉的TBS（pH 8.0）封闭2 h;分别加入适量Bc1-2、Bax 鼠单抗IgG （1∶400）、Caspase-3兔多抗IgG（1∶400），摇床上室温反应2 h，洗膜3次，20 min/次;加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（1∶6000），室温反应2 h;洗膜后作ECL化学发光，X光显影。图像经扫描仪扫描后，用图像分析软件Band Scan 5.0进行吸收度积分值分析，计算目的蛋白与内参照GAPDH蛋白表达量的吸收度积分值之比作为目的蛋白表达量的相对含量，实验重复3次。

1.4统计学方法  本研究全部数据采用SPSS 11.0统计软件进行统计分析，计数资料以（x±s）表示，进行单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 MTX对Ⅱ型胶原蛋白诱导大鼠足肿胀的抑制作用  与模型组比较，MTX抑制大鼠足肿胀的作用呈剂量依赖性，模型的足肿胀度越高，MTX的抑制作用越强，药物在致炎后28 d左右抑制作用达到峰值，见图1。其中，以高剂量给药组最为明显（P<0.05），与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2 MTX对RA滑膜细胞凋亡的影响  流式细胞术检测各组凋亡细胞结果见图2，以右上和右下象限为凋亡细胞，统计各组凋亡细胞百分率。各组均能不同程度诱导RA滑膜细胞凋亡，以高剂量给药组的作用最明显。与模型组及假模型组比较，高剂量给药组明显诱导RA滑膜细胞凋亡（P<0.05）。

2.3对大鼠关节滑膜细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bax、Bcl-2 蛋白表达的影响  高剂量给药组的Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达量与模型组比较明显上调，Bc1-2蛋白表达量下降（P<0.01），见图3。

3讨论

RA是一种病变累及周围关节的多系统性炎症性的自身免疫病，主要表现为慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变，若未早期诊治，在发病两年内即可出现不可逆的骨关节破坏，造成关节畸形及功能丧失，最终残疾[5]。研究表明[1]，RA的关节软骨和骨组织损害与滑膜细胞过度增生活化及凋亡不足密切相关。因此，抑制自身免疫反应的细胞增殖及促进该免疫反应的细胞凋亡，阻止关节滑膜中炎性细胞的浸润可减轻关节炎病变，是治疗该病的重要途径。

MTX是目前公认的有效治疗RA的免疫抑制剂，其通过对腺苷诱导的免疫抑制作用、对炎性细胞增殖和凋亡的影响及对单核细胞和淋巴细胞因子及其抑制因子的作用等，降低滑膜组织金属蛋白酶水平，发挥抗炎及免疫抑制作用[6，7]。许多RA患者单用MTX即可使炎症缓解，疾病活动性得到明显的控制，且单药治疗除了极高的卫生经济学价值外，还有相当好的安全性。有研究对服用MTX的RA患者的长期随访研究发现患者的关节肿痛晨僵血沉及C-反应蛋白的指标在6个月左右开始显著改善。本研究中CIA大鼠造模后关节出现明显肿胀，以后肢最为明显，在第28天达到了高峰。治疗后，高剂量治疗组肢体炎症的肿胀程度与模型组相比均有改善。结果表明MTX的应用对局部关节炎症均有明显控制作用，这与文献报道相一致[8]。

本研究中给药组滑膜细胞的凋亡幅度明显上升，与模型组差异显著，模型组大鼠滑膜组织的Bcl-2表达增加，而Caspase-3、Caspase-9、Bax蛋白表达下降，提示滑膜细胞凋亡相关基因表达异常，导致细胞增生与凋亡的不平衡，引起滑膜细胞增生。而MTX可以使从大鼠滑膜细胞Bc1-2表达减少，Caspase-3、Caspase-9、Bax表达明显升高。提示MTX可能通过调控Bcl-2和Bax等凋亡相关基因，并诱导RA滑膜细胞Caspase-3、9活化，促进滑膜细胞的凋亡，从而抑制关节滑膜细胞的增殖，减轻滑膜增厚而发挥治疗作用。

综上所述，通过MTX对大鼠类风湿性关节炎模型滑膜细胞凋亡基因调控的实验研究，初步证明了MTX对RA滑膜细胞较强的诱导凋亡作用。MTX在诱导RA滑膜细胞凋亡的作用机制较为复杂，涉及体液、内分泌、免疫网络中的多种调节因子、多种转录、代谢调控因素，故还需从其他相关基因或蛋白表达方面做进一步研究。

参考文献：

[1]Seca S，Kirch S，Cabrita AS，et al.Evaluation of the effect of acupuncture on hand pain，functional deficits and health-related quality of life in patients with rheumatoid arthritis-A study protocol for a multicenter，double-blind，randomized clinical trial[J].J Integr Med，2016，（3）：219-227.

[2]Derk CT.Rheumatoid arthritis： an update[J].Del Med J，2015，77（2）：59-63.

[3]Kawai S.Current drug therapy for rheumatoid arthritis[J].J Orthop Sci，2013，8（2）：259-263.

[4]Isomaki P，Junttila I，Vidqvist KL，et al.The activity of JAK-STAT pathways in rheumatoid arthritis： constitutive activation of STAT3 correlates with interleukin 6 levels[J].Rheumatology （Oxford），2015，54（6）：1103-1113.

[5]李娟.艾拉莫德與甲氨蝶呤配伍治疗老年类风湿关节炎84例[J].陕西医学杂志，2016，45（1）：120-121.

[6]Kakinohana M，Kida K，Minamishima S，et al.Delayed paraplegia after spinal cord ischemic injury requires caspase-3 activation in mice[J].Stroke，2011，42（8）：2302-2307.

[7]Yilmaz ER，Kertmen H，Dolgun H，et al.Effects of darbepoetin-α in spinal cord ischemia-reperfusion injury in the rabbit[J].Acta Neurochir （Wien），2012，154（6）：1037-1044.

[8]霍爱鑫.肿瘤坏死因子拮抗剂联合甲氨蝶呤治疗活动期中重度类风湿关节炎56例对比观察[J].陕西医学杂志，2015，44（9）：1209-1211.

收稿日期：2019-11-07;修回日期：2020-03-15

编辑/肖婷婷