microRNA-373及TRPS1在喉癌组织中的表达及其临床意义

马奕枞 王雪峰

摘要：目的  分析microRNA-373（miR-373）及直接靶标基因TRPS1在喉癌组织中的表达水平及其临床意义。方法  收集2018年1月～2019年12月锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科确诊为喉癌并行手术治疗的55例患者的喉癌组织及42例癌旁正常上皮组织。所有标本在取材前均未行任何抗肿瘤治疗，采用SYBR Green qRT-PCR方法检测患者癌组织及对应癌旁正常上皮组织中miR-373表达情况，采用免疫荧光法测量其靶标基因TRPS1在喉癌组织中的表达水平，并分析miR-373、TRPS1与临床病理特征的关系。结果  miR-373及TRPS1在喉癌组织中的表达均高于癌旁正常上皮组织（P<0.05）;不同 TNM 分期和淋巴结转移间 miR-373 相对表达量及TRPS1比较，差异有统计学意义（P<0.05）;但不同年龄、性别、吸烟、饮酒及分化程度间 miR-373 相对表达量及TRPS1比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论  miR-373及TRPS1在喉癌组织中的表达升高，且与淋巴结转移及肿瘤TNM分期有关。

关键词：喉癌;miR-373;TRPS1

中图分类号：R739.65                                文献标识码：A                                 DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.05.001

文章编号：1006-1959（2020）05-0001-04

Abstract：Objective  To analyze the expression level and clinical significance of microRNA-373 （miR-373） and direct target gene TRPS1 in laryngeal cancer. Methods  From January 2018 to December 2019， the laryngeal cancer tissues and 42 normal epithelium tissues adjacent to the cancer were collected from 55 patients diagnosed with laryngeal cancer and surgically treated in the first hospital of Jinzhou Medical University. All specimens were not subjected to any anti-tumor treatment before material extraction. SYBR Green qRT-PCR was used to detect miR-373 expression in cancer tissues and normal epithelial tissues adjacent to the cancer. Immunofluorescence was used to measure the target gene TRPS1 in laryngeal cancer. The expression level in the tissues， and the relationship between miR-373， TRPS1 and clinicopathological characteristics were analyzed. Results  The expressions of miR-373 and TRPS1 in laryngeal cancer tissues were higher than those in normal epithelium adjacent to the cancer （P<0.05）;Comparison of miR-373 expression and TRPS1 in different TNM stages and lymph node metastasis were statistically significant（P<0.05）;but comparison of miR-373 expression and TRPS1 in different ages，sex， smoking， drinking and differentiation degree with no statistically significant （P>0.05）. Conclusion  The expression of miR-373 and TRPS1 in laryngeal cancer tissues is increased， and it is related to lymph node metastasis and tumor TNM stage.

Key words：Laryngeal cancer;miR-373;TRPS1

喉癌（laryngeal cancer）是頭颈部最常见的恶性肿瘤之一，从病理学类型上来看，大多数的喉癌为鳞状细胞癌[1]。近年来尽管喉癌的诊断和对应的手术治疗及放射治疗都有了显著进步，但全球每年仍有超过8万的喉癌患者死亡[2]。目前，喉癌治疗方法以手术切除为主，联合术前或术后化疗、放疗等综合治疗[3]。微小RNA（microRNA）是一类具有18～25个核苷酸长度的内源性微小非编码RNA。miRNA可以通过与靶基因的3'非翻译区（3'UTR）配对来调节mRNA的水平和或抑制靶基因的翻译[4]。通过大量数据分析，miRNA在多种人类癌症中高表达，且与肿瘤的发生、发展及其转移中起关键作用[5]。从功能上来说，miRNA参与细胞增殖、分化、凋亡和移行[6，7]。一些特定的miRNA被认为是喉癌的生物标记和治疗靶点[8]。miRNA-373在乳腺癌、食管癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、胃癌细胞等多种肿瘤中的迁移和侵袭中发挥重要作用[9]。但目前关于miR-373在喉癌的表达情况及其与临床特征的关系尚不清楚，而TRPS1作为miR-373的标靶基因[10]，其与喉癌的关系研究较少。因此，本研究采用SYBR Green qRT-PCR及免疫荧光检测技术，检测喉癌组织和对应癌旁组织miR-373及TRPS1的表达情况，分析miR-373及TRPS1表达与喉癌临床病理特征的关系，为今后喉癌的临床研究及早期诊断奠定基础，现报道如下。

1资料与方法

1.1组织标本来源  收集2018年1月～2019年12月锦州医科大学附属第一医院耳鼻咽喉头颈外科确诊为喉癌并手术治疗的55例患者的喉癌组织及42例癌旁正常上皮组织，研究经医院伦理委员会批准。其中男性50例，女性5例，年龄47～81岁，平均年龄（65.01±8.10）岁;分化程度：高23例、中21例、低11例;TNM分期：T1期10例、T2期18例、T3期17例、T4期10例;类型：声门型38例、声门上型17例。所有标本在取材前均未行任何抗肿瘤治疗。

1.2材料和仪器  核酸提取试剂盒（厦门艾德生物医药有限公司），特异性多克隆兔抗人TRPS1抗体（博奥森生物技术有限公司），山羊抗兔抗体（Abcam公司），奥林巴斯荧光共聚焦显微镜（Leica TCS sp5Ⅱ，德国Leica公司），实时荧光定量PCR仪（Quant Studio3，美国Thermo Fisher Scientific公司），还原第一链cDNA合成试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，美國Thermo Scientific公司），Power SYBR   Green PCR Master Mix（美国Thermo Scientific公司）。

1.3实验方法

1.3.1实时荧光定量PCR法检测miR-373表达水平  采用Trizol提取喉癌细胞组织和正常癌旁组织中总RNA，向每孔细胞中加入1 ml Trizol 进行裂解，将裂解液转移至干净EP管中，采用氯仿/异丙醇处理后收集白色RNA沉淀;用预冷75%乙醇洗涤，4℃ 12000 r/min离心10 min后弃上清。自然晾干后用DEPC水溶解RNA，采用One Step Prime Script miRNA cDNA Synthesis Kit按照说明书合成cDNA。使用One Step SYBR Prime Script TM QPCR Kit遵循试剂盒说明书于美国ABI 7300 QPCR System仪上进行，反应条件如下：95℃变性30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。以U6作为内参（U6上游引物为GTGCTCGCTTCGGCAG-CATA，下游引物为GGAACGCTTCACAATTTGC-GTGTC;miRNA-373上游引物为TACTCAAAAT-GGGGGCGCTT，下游引物为GGGACACCCCAA-AATCGAAG）。采用2-△△Ct表示miR-373的相对表达量。

1.3.2免疫组织荧光染色法石蜡切片免疫组织荧光染色  具体步骤如下：①切片常规脱蜡至水;②将切片放入柠檬酸钠缓冲液中，微波炉低火加热15 min，用PBS冲洗一次，5 min;③加入500 μl封闭液，37℃孵育20 min;④滴加稀释的一抗工作液兔抗RRP15，37℃孵育 2 h，用PBS冲洗3次;⑤滴加500 μl第二抗体，37℃湿盒孵育1 h，用PBS冲洗3次;⑥滴加500 μl的DAPI，37℃湿盒孵育5 min，用PBS洗3次，封片。制备42例喉癌病人的癌组织及癌旁组织的石蜡切片，进行免疫荧光染色，在荧光显微镜下以相同曝光时间进行图像采集，之后用Image Pro Plus统计其荧光强度。

1.4统计学分析  采用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，组间比较采用t检验;以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 miR-373在喉癌组织及癌旁正常组织中的表达情况  喉癌组织中miR-373的表达量高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），见图1。

2.2 miR-373相对表达量与临床病理特征的关系  不同TNM分期和淋巴结转移间miR-373相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）;但不同年龄、性别、吸烟、饮酒及分化程度间miR-373相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表1。

2.3 TRPS1在喉癌组织及癌旁正常组织中的表达情况  喉癌组织中TRPS1的荧光强度高于癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2.4平均荧光密度值与临床病理特征的关系  不同TNM分期和淋巴结转移间TRPS1平均荧光密度值比较，差异有统计学意义（P<0.05）;但不同年龄、性别、吸烟、饮酒及分化程度间TRPS1平均荧光密度值比较，差异无统计学意义（P>0.05），见表2。

3讨论

大量研究显示，miRNA与多种肿瘤的发生、发展、侵袭、转移和凋亡密切相关[11]。miR-373在多种肿瘤中均出现异常表达，其不仅与患者的肿瘤细胞发展有关，还与临床病理特征具有相关性。刘文稚的研究发现[12]，miR-373在食管癌组织中的表达明显高于癌旁组织，并且其表达与分化程度、肿瘤T分期及淋巴结转移相关。Syring I等[13]研究显示，miR-373在睾丸生殖细胞肿瘤以及乳腺癌中表达上调，且其水平与病理分期和临床分期呈正相关。本研究通过实时定量PCR检测分析，结果显示喉癌组织中miR-373的表达量高于相应的癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05），提示miR-373与喉癌的发生与发展有关。不同TNM分期和淋巴结转移间miR-373相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05）;但不同年龄、性别、吸烟、饮酒及分化程度间miR-373相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），推断miR-373可能对喉癌的增殖及转移有一定调控作用，其可能为评估喉癌的早期诊断标志物。

TRPS1是一种新发现的GATA家族转录因子，研究证明其编码产物在人类卵巢、前列腺、肺、乳腺、肾中广泛表达，而且主要存在于细胞核中，参与了多种癌细胞周期调控，在癌症发展中起到至关重要的作用[14]。TRPS1基因编码的转录因子通过特异性结合GATA序列抑制多个GATA家族成员，从而调控下游基因的表达。在TRPS1的3ˊUTR区域存在miR-373的结合位点，由此可以确定此结合位点是miR-373靶向调控TRPS1的核心序列，证实了miR-373可以直接靶向结合到TRPS1的3ˊUTR的区域来调节TRPS1的表达。有研究发现[10]，TRPS1是miR-373的一个关键靶向基因，miR-373通过靶向调节TRPS1在乳腺癌中的表达，从而促进乳腺癌EMT和侵袭转移，说明miR-373及其靶标基因TRPS1的表达与恶性肿瘤的生长和转移存在相关性。本研究通过免疫荧光检测技术进一步证实了miR-373的标靶基因TRPS1在喉癌组织中的荧光强度高于癌旁组织，不同TNM分期和淋巴结转移间TRPS1平均荧光密度值比较，差异有统计学意义（P<0.05），与miR-373在喉癌组织中的结果相似，证明了TRPS1在喉癌发生发展中发挥作用。

综上所述，喉癌中miR-373及其靶标基因TRPS1的表达量高于癌旁组织，且有淋巴结转移及分化程度也对表达量有一定的影响，恶性程度越高其表达量亦越高，可以推测出miR-373分子及其调控的TRPS1基因影响着喉癌的发展，对喉癌的基因检测及靶向治疗有着一定的指导意义，但发挥作用的具体机制仍需今后进一步探索。

参考文献：

[1]Jenckel F，Knecht R.State of the art in the treatment of laryngeal cancer[J].Anticancer Res，2013，33（11）：4701-4710.

[2]Fusconi M，Campo F，Gallo A，et al.Laryngeal Cancer，HPV DNA vs E6/E7 mRNA Test：A Systematic Review[J].J Voice，2017，31（2）：e1-e5.

[3]衡宇，陶磊.原发性声门下喉癌的治疗方式[J].中国眼耳鼻喉科杂志，2019，19（1）：66-68.

[4]Karnati HK，Panigrahi MK，Gutti RK，et al.miRNAs：Key Players in Neurodegenerative Disorders and Epilepsy[J].J Alzheimers Dis，2015，48（3）：563-580.

[5]Zhang C，Gao W，Wen S，et al.Potential key molecular correlations in laryngeal squamous cell carcinoma revealed by integrated analysis of mRNA，miRNA and lncRNA microarray profiles[J].Neoplasma，2016，63（6）：888-900.

[6]Ivey KN，Muth A，Arnold J，et al.Micro RNA regulation of cell line ages in mouse and human embryonic stem cells[J].Cell Stem cell，2008，2（3）：219-229.

[7]Li B，Wu N，Zhang XJ，et，al.Micro RNA-409 inhibits the prolife rative ability of cervical carcinoma cells by regulating AKT[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2018（22）：936-942.

[8]Yuan Y，Zeng ZY，Liu XH，et al.MircroRNA-203 inhibits cell proliferation by repressing Deltanp63ex-pression in human esophageal squamous cell carcinoma[J].BMC Cancer，2011（11）：57.

[9]鄭素娟，李力.miR-373与肿瘤相关作用的研究进展[J].生命科学，2019，31（10）：1012-1018.

[10]黄金舟.miR-373调控乳腺癌侵袭转移的功能机制及临床意义研究[D].暨南大学，2017.

[11]Kunz M，Xiao K，Liang C，et al.Bioinformatics of cardiovascular miRNA biology[J].Journal of Molecular and Cellular Cardiology，2014：S0022282814003873.

[12]刘文稚.miR-373在食管鳞状细胞癌中的功能及作用机制研究[D].山东大学，2016.

[13]Syring I，Bartels J，Holdenrieder S，et al.Circulating serum miRNA （miR-367-3p，miR-371a-3p，miR-372-3p and miR-373-3p）as biomarkers in patients with testicular germ cell cancer[J].J Urol，2015，193（1）：331-337.

[14]Wu L，Wang Y，Liu Y，et al.A central role for TRPS1 in the control of cell cycle and cancer development[J].Oncotarget，2014，5（17）：7677-7690.

收稿日期：2020-01-02;修回日期：2020-01-10

编辑/杜帆