骨肉瘤中miR-194的表达水平及其与临床病理参数的关系

汪勇刚

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤[1]。20世纪初期，骨肉瘤5年生存率不到20%，随着辅助化疗、放疗手段和手术技术的进步，局部骨肉瘤患者的长期生存率已提高到约60%[2]。然而，肿瘤细胞转移是大多数骨肉瘤患者死亡的首要原因，无转移骨肉瘤患者的5年生存率为70%，当临床出现转移时，骨肉瘤患者的5年生存率不到30%[3]。因此探寻新的治疗靶点和方法来抑制骨肉瘤发展、转移并改善预后具有十分积极的意义。miRNA是长21～25 nt的非编码RNA分子，其通过靶向结合mRNA的3′非翻译区(3′UTR)来抑制转录和转录后水平表达，发挥致癌基因或抑癌基因的功能，与骨肿瘤、胃癌、肺癌等多种肿瘤发生进展和转移密切相关[4]。目前，miRNA已成为基因治疗骨肉瘤的新研究热点。本研究选取我院2011年1月～2013年1月病理科68例骨肉瘤患者的外检档案，旨在探讨骨肉瘤组织中miR-194的表达水平及其与临床病理参数的关系，以期为骨肉瘤新治疗靶点的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 病例资料68例冻存骨肉瘤组织及其对应的癌旁组织标本(组织从体内取出后立即储存于液氮环境中)，男37例，女31例，年龄8～70(17.65±7.32)岁，病程1～24(5.62±1.54)个月。软组织浸润23例，无软组织浸润45例。肿瘤转移39例，肿瘤无转移29例。肿瘤位于股骨下端27例，胫骨上端20例，肱骨上端6例，其他部位15例。临床分期(Enneking外科分期)：Ⅰ期15例，Ⅱa期18例，Ⅱb期17例，Ⅲ期18例。参照Dahlin标准的组织学分型：普通性中心型54例(骨母细胞型39例，软骨母细胞型9例，纤维母细胞型6例)，血管扩张型5例，小圆细胞型5例，骨旁型4例。患者手术前均未行放疗、化疗，且患者临床资料及术后随访资料均完整。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 荧光定量实时PCR(qRT-PCR)使用qRT-PCR检测骨肉瘤及癌旁组织标本中miR-194表达水平。使用TRIzol试剂(Invitrogen公司)从液氮冻存的组织提取总RNA。使用Reverse Transcription Kit(Takara公司)将RNA反转录为cDNA。使用SYBR Green(Takara公司)进行实时PCR分析。利用ABI7500系统进行qRT-PCR反应。以U6作为内参。本研究引物设计均由上海生工合成，引物设计如下，miR-194：5′-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3′；5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。PCR反应体系：使用50 μl PCR反应体系，10X Buffer 5 μl，2.5 mmol/L dNTP 4 μl，taq酶0.5 μl，Pmix 2.5 μl，上游引物和下游引物各1 μl，ddH2O 36 μl。PCR反应条件：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性25 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31个循环。应用2-ΔΔCt法计算miR-194相对表达量。

2 结果

2.1 miR-194在骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达情况与癌旁组织中miR-194的2～8(5.61±1.33)表达水平相比，骨肉瘤组织中miR-194的1～5(3.63±0.65)表达显著降低，差异有统计学意义(t=8.408，P<0.001)。68例骨肉瘤组织中miR-194表达水平的平均值为3.63，以此作为标准进行分组，27例标本显示较高水平miR-194表达，记为高表达组；41例标本显示较低水平miR-194表达，记为低表达组。

2.2 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床参数的关系见表1。骨肉瘤组织中miR-194的表达水平与患者性别、肿瘤大小和肿瘤部位等临床参数无明显关系(P>0.05)，而与患者年龄有明显关系(P<0.05)。随患者年龄的增加，miR-194表达水平上调。

表1 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床参数的关系(例)

2.3 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床分期的关系见表2。随着临床分期的增加，miR-194表达水平逐渐降低，miR-194的表达水平与临床分期显著相关(χ2=15.859，P=0.001)。与Ⅰ期、Ⅱa期患者相比，Ⅲ期患者miR-194表达水平显著降低，差异均有统计学意义(χ2=10.790，P=0.001；χ2=4.713，P=0.030)。Ⅱb期患者miR-194表达水平显著低于Ⅰ期患者，差异有统计学意义(χ2=6.149，P=0.013)。

表2 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床分期的关系(例)

2.4 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床特征的关系见表3。软组织浸润患者miR-194表达水平显著低于无软组织浸润患者，差异有统计学意义(P<0.001)。与无转移患者相比，转移患者miR-194表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.001)。

表3 骨肉瘤组织中miR-194表达与临床特征的关系(例)

2.5 骨肉瘤组织中miR-194表达与组织学分型的关系见表4。miR-194在普通性中心型、血管扩张型、小圆细胞型及骨旁型中的表达水平比较差异无统计学意义(χ2=3.723，P=0.590)。

表4 骨肉瘤组织中miR-194表达与组织学分型的关系(例)

2.6 骨肉瘤组织中miR-194表达与患者术后累积生存率的关系68例骨肉瘤患者随访时间6～48个月，22例死亡32.35%(22/68)。Kaplan-Meier生存曲线显示，miR-194高表达组患者中位生存时间为30.40个月，累积生存率为81.48%(22/27)；而低表达组中位生存时间为23.71个月，累积生存率为58.54%(24/41)；两组比较差异有统计学意义(χ2=4.138，P=0.042)。见图1。

图1 miR-194表达与患者预后的关系 两组比较：χ2=4.138，P=0.042

3 讨论

3.1 miRNA在肿瘤组织中作用骨肉瘤的发生、发展过程与多种致癌基因及抑癌基因的表达相关。致癌基因或抑癌基因表达异常通过调控细胞增殖、迁移参与肿瘤发生、发展过程。miRNA靶向结合mRNA的3′UTR抑制转录和转录后水平表达，通过调节其他肿瘤抑制因子或致癌基因表达而起致癌基因或抑癌基因的作用。生物信息学研究表明，1/3的已知基因可能被miRNA调控。自发现miRNA在秀丽隐杆线虫发育中的作用以来，已观察到大量miRNA谱系的异常表达与癌症有关，包括骨肿瘤、结肠癌、乳腺癌、胃癌等。在癌症中，miRNA调节异常影响下游靶点，并进一步影响致瘤性发生如增殖、转移和凋亡的常见特征[5]。因此，miRNA在肿瘤组织中的表达可作为诊断、治疗和预后评估的新靶点。

3.2 miRNA在骨肉瘤中作用多种miRNA表达的上调或下调与骨肉瘤的发生、进展和转移密切相关。Montanini et al[6]通过对骨肉瘤细胞系MG-63和143B进行表达谱分析发现，miR-93的高表达状态促进骨肉瘤细胞转移。有研究发现[7-8]miR-143表达的上调对骨肉瘤的转移起抑制作用。Fei et al[9]发现，miR-9表达水平的上调与骨肉瘤TNM分期密切，且miR-9表达水平的降低与患者预后不良有关。Tian et al[10]发现，miR-34b表达水平的降低与患者患病风险和肿瘤远处转移密切相关。这些研究表明，miRNA可作为致癌基因或抑癌基因参与骨肉瘤发生进展过程。

3.3 miR-194临床研究结果miR-194是潜在的抑癌基因，通过下调多种靶标，如SSH2、HBEGF、TLN2、CDH2、IGF1R等，起到肿瘤抑制基因的作用。miR-194在胃肠癌细胞中的过表达可抑制癌细胞的迁移、侵袭和转移[11]。靳雷 等[12]通过转染miR-194模拟物增强骨肉瘤细胞系SOSP9607中miR-194的表达发现，miR-194的上调能够显著抑制细胞增殖，并促进细胞凋亡。白马恒 等[13]通过构建不同表达水平miR-194的骨肉瘤细胞系发现，miR-194能够抑制骨肉瘤细胞的转移。另外，杜香 等[14]通过构建动物模型发现，miR-194可以抑制裸鼠体内骨肉瘤的增殖及肺部转移。这些研究提示，miR-194在骨肉瘤中起抑癌基因的作用。然而miR-194在骨肉瘤组织中的表达及其临床病理或预后意义尚不清楚。本研究发现，骨肉瘤组织中miR-194的表达水平显著降低，提示miR-194在骨肉瘤的发生发展中可能起抑癌基因的作用。研究显示miR-194的低表达与胃癌临床晚期分期有关[15]。本研究通过分析miR-194与骨肉瘤患者临床病理参数的相关性发现，随着临床分期的增加，miR-194表达水平逐渐降低，miR-194表达水平的下调与晚期临床分期有关，提示癌组织中miR-194表达水平的下调与骨肉瘤的发病进程相关，可预测骨肉瘤的发病进展，并判断患者的恶性程度。另外，软组织浸润和转移患者组织中miR-194表达水平显著降低，这与Cai et al[16]研究结果基本一致，提示肿瘤组织中miR-194表达水平的下调与肿瘤转移密切相关。王时光 等[17]发现，miR-194表达水平是结直肠癌患者预后的独立危险因素，可作为结直肠癌诊断与预后判断的生物标志物。本研究对患者进行Kaplan-Meier生存分析发现，miR-194高表达患者5年生存率显著高于miR-194低表达患者，说明miR-194表达失调与骨肉瘤患者的生存预后密切相关，可作为骨肉瘤预后判断的生物标志物。

综上所述，骨肉瘤组织中miR-194表达水平显著下调，与患者临床分期、软组织浸润、肿瘤转移等临床病理特征有关，其低表达与患者预后不良密切相关，可作为骨肉瘤预后判断的生物标志物。