“美早”甜樱桃褐腐病病原菌的分离及内生拮抗细菌的筛选鉴定

郗良卿，张士凯，陈雨诗，周一宁，张启月，辛力，张倩*，吴澎*

1(山东农业大学，山东 泰安，271000) 2(山东省果树研究所，山东 泰安，271000)

甜樱桃又名大樱桃，是蔷薇科、李属、樱桃亚属植物，多产于欧洲与亚洲，19世纪70年代从欧洲传入中国[1-2]。甜樱桃可直接食用，也可经过干燥、腌制加工成果酱、水果汁以及罐头等食品。甜樱桃含铁丰富(8mg/100g)，约为苹果、梨的20～30倍[3]；还富含多种酚类化合物，如羟基肉桂酸、原花青素、黄酮醛及花青素等，具有较强的抗氧化能力[4]，在预防疾病与人体健康方面起着至关重要的作用[5]。

甜樱桃果实在贮藏过程中易发生失水、软化、褐变及病原真菌侵蚀腐败的现象，导致果实腐烂，其真菌性病原微生物的侵染是造成果实采后腐烂的主要原因，引起的腐烂损失可达总损失50%以上[6]。目前国内甜樱桃主要采后病害有青霉病、灰霉病、根腐病、褐腐病、黑腐病和黑斑病等[7-8]，导致其病害的真菌性病原菌有扩展青霉菌(Penicilliumexpansum)[9]、美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)[10]、葡萄孢霉菌(Botrytiscinerea)、根霉菌(Rhizopussp.)[11]、毛霉菌(Mucorsp.)[12]、链格孢霉(Alternariaalternata)及炭疽菌(Colletotrichumsp.)[13]、黑曲霉(Aspergillusniger)等[14-15]。

“美早”甜樱桃果个大、肉硬、色泽鲜丽，无畸形果，品质优，种植面积广且产量大[16]，是山东泰安地区甜樱桃主要品种，其褐腐病引起的果实腐败造成了严重的经济损失，是政府和果农亟待要求解决的重要问题。国内报道的甜樱桃褐腐病是由真菌链核盘菌属(Moniliniaspp.)侵染所导致的，主要分为3个种：核果链核盘菌[Monilinialaxa(Aderh. et Ruhl.) Honey]、美澳型核果褐腐病菌[M.fructicola(Wint.)Honey][10]和果生链核盘菌[M.fructigena(Aderh. et Ruhl.) Honey][17]。目前山东泰安地区尚未明确“美早”甜樱桃褐腐病的优势致病菌及其防治措施，因此确定“美早”甜樱桃褐腐病优势致病菌并进行分离鉴定，在此基础上有针对性地筛选内生拮抗菌，明确甜樱桃褐腐病的生物防治方法，对减少果农损失、有效制定防治工作具有重要意义。

甜樱桃采后防腐保鲜的方法主要分为物理保鲜和化学保鲜法[18]。物理保鲜(低温、CA、辐照、热处理)具有成本高，保鲜期短等缺点；化学保鲜剂(CaCl2、ClO2、1-MCP、植物精油)作为一种常用的保鲜手段，虽然效果较为理想，但长期使用会导致病原菌产生抗药性，且存在一定的食品安全隐患[19]。因此相对低成本、安全健康、对环境友好的微生物拮抗保鲜法成为当下研究热点[20]。在甜樱桃采后保鲜的拮抗微生物中，国内已报道的主要有罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)[21]、芽孢杆菌属(Bacillusspp.)[22-23]等外源拮抗菌株，而尚未查阅到甜樱桃内生拮抗菌株报道。

本文明确鉴定了导致山东泰安地区“美早”甜樱桃褐腐病的主要病原菌，从健康甜樱桃本身分离筛选得到内生拮抗菌株，不仅能够解决当前面临的“美早”鲜果腐烂问题，还可为其他品种甜樱桃采后防腐保鲜技术提供新思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甜樱桃为山东省果树研究所天平湖基地(泰安)采集的“美早”甜樱桃。

λDNA(TIANGEN Lot.L0525)、DL2000(TAKARA Lot.A2201A)、6×Loading buffer(TAKARA Lot.A7301A)、50×TAE(CWBIO Lot.10142)、2×Es Taq MasterMix等，均由北京索莱宝科技有限公司提供。

1.2 仪器与设备

303-00A型电热恒温恒湿生化培养箱，天津赛得利斯实验分仪器制造厂；XFC-100CA型高压蒸汽灭菌锅，浙江新丰医疗器械有限公司；XSP-63A型荧光显微镜，上海光学仪器一厂；电泳仪，北京市六一仪器有限公司；PCR仪，德国Biometra公司；ChamlGel6000型全自动凝胶成像分析系统，北京赛智创业科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌的分离鉴定与致病性验证

1.3.1.1 病原菌的分离纯化

将腐败“美早”甜樱桃样品先用75%(体积分数)医用酒精进行表面消毒，再用无菌水清洗表面3次，自然风干，用无菌刀片和镊子切取少量腐败果实组织，将其置于抗性(链霉素、青霉素)PDA培养基中央， 28 ℃恒温恒湿生化培养箱培养3～4 d。待平板菌落长出后，挑取菌落边缘菌块置于另一PDA培养基，28 ℃培养，多次纯化，直至单一菌落为止。将单一菌落接种于试管斜面，于4 ℃冰箱中保藏备用。以上操作均在无菌环境下进行。

1.3.1.2 病原菌致病性检测

根据柯赫氏法则[24-26]验证，将分离纯化的单一菌落置于PDB试管中，28 ℃、180 r/min培养48 h，制成浓度为1×106CFU/mL菌悬液。取健康表面无任何损伤的“美早”甜樱桃，用75%医用酒精浸泡20 s，再用无菌水清洗3次，自然晾干，用无菌牙签在果实赤道部位刺3 mm×3 mm×3 mm的伤口一处，吸取10μL 1×106CFU/mL菌悬液置于伤口处，待果实自然吸取完后将果实放于密封袋中，28 ℃恒温培养3 d，重复3次，观察发病程度。将发病明显的果实进行病原菌的分离鉴定，判断与所接种的菌株形态是否一致。

其中，果实根据腐烂程度可分为5个等级[27]，分级标准如表1所示。

表1 果实发病级别Table 1 Fruit morbidity grade

1.3.1.3 病原菌形态学观察

将分离纯化的病原菌放于PDA培养基，28 ℃培养3～5 d，进行菌落形态观察。

将无菌盖玻片以∠45°插入PDA培养基中央，挑取单一菌落置于盖玻片与PDA培养基的交界处，28 ℃培养3～7 d，将盖玻片取出，用酒精棉球轻轻擦拭盖玻片另一面，将菌丝生长旺盛的一面与滴有1滴乳酸酚棉蓝染液的载玻片接触，在显微镜下观察菌丝体和孢子生长情况[28]。

1.3.1.4 病原菌生物学鉴定

将单一菌落接种至PDB培养基中， 28 ℃、150 r/min培养48 h，制成菌悬液。挑取100 mg菌丝球液氮研磨3次，按照真菌基因组试剂盒法提取DNA。将提取的DNA置于-20 ℃保藏备用。

本试验采用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGAT-ATGC-3′),均由华大基因科技有限公司合成。PCR扩增体系为25 μL，如表2所示。PCR反应条件由表3可知，其中变性、退火和延伸3个步骤共30个循环，最后4 ℃保存。

表2 PCR反应体系Table 2 PCR reaction system

表3 PCR反应条件Table 3 PCR reaction conditions

PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳、Goldview Ⅱ染色，用凝胶成像系统观察条带并记录结果。PCR产物由睿博兴科生物技术有限公司纯化后测序。将测序结果在NCBI网站上进行Blast比对，在GenBank数据库中同源性比较，选择同源性较高的菌株序列，利用MEGA 7.0软件构建系统发育树。

1.3.2 内生拮抗细菌的分离、筛选与鉴定

1.3.2.1 内生细菌的分离纯化

取30颗健康“美早”甜樱桃整果研磨，称取1 g果肉加入9 mL无菌生理盐水中，混匀配成原液，静置20 min。采用梯度稀释法将去稀释成10-3、10-4、10-5的浓度稀释液，分别取100 μL涂布于LB培养基中，每个梯度设3个平行， 37 ℃恒温恒湿培养24 h。

将生长出的菌落接种至另一LB培养基上进行三区划线，37 ℃培养，直至长出单菌落。将单菌落挑取至LB斜面，待菌落长出后置于4 ℃保藏。

1.3.2.2 内生拮抗细菌的筛选

采用滤纸片法，在培养病原菌7～10 d的PDA平板上取6 mm菌饼，将其接种于另一PDA平板中央，将6 mm无菌滤纸片置于距病原菌2.5 cm处，吸取6 μL内生细菌发酵液打在滤纸片上，每个板3个平行，以仅接种病原菌的平板作为对照，重复3次，28 ℃恒温培养5～7 d，观察菌落直径及抑制率[29]。抑制率的计算如公式(1)所示：

抑制率/%=

(1)

1.3.2.3 内生拮抗细菌形态鉴定及生理生化指标鉴定

将分离纯化的内生拮抗细菌置于LB培养基，37 ℃恒温培养24 h，进行菌落形态观察，并对菌株进行革兰氏染色在油镜下观察菌落的形态特征。

内生拮抗细菌的生理生化特征鉴定具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[30]和《伯杰细菌鉴定手册》[31]。

1.3.2.4 菌株X-16的rDNA序列分析

采用细菌基因组提取试剂盒法提取X-16基因组DNA，利用细菌通用引物27F(5′- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和 1 492r (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行 PCR 扩增，用1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物，并对其进行测序。序列在 GenBank上进行序列 Blast比对，选择具有代表性的菌株序列，利用MEGA 7.0软件进行聚类分析构建系统发育树。

1.3.3 拮抗菌X-16不同处理液对病原菌的拮抗效果

1.3.3.1 拮抗菌X-16生长曲线的测定

将菌株X-16活化，按2%接种量分别接种于 NB培养基中， 37 ℃、150 r/min 恒温振荡培养，分别于0、2、 4、 6、 8、 10、 12、 14、 16、 18、 20、 24和26 h取样，以未接种的空白 NB 培养基作为对照，利用紫外分光光度计测定其600 nm处的吸光度，重复3次，每次3个平行，绘制出菌株的生长曲线。

1.3.3.2 拮抗菌菌悬液对病原菌的拮抗作用

将培养到平稳期的拮抗菌液制成浓度为1×108CFU/mL菌悬液，按照1.3.2.2中的方法进行抑制率的测定。

1.3.3.3 拮抗菌发酵液和发酵上清液对病原菌的拮抗作用

将活化的菌株X-16按2%接种量接种于 NB培养基中， 37 ℃、150 r/min 恒温振荡培养72 h，12 000 r/min离心2 min，过0.22 μm滤膜得发酵上清液。将培养72 h的发酵液稀释至浓度1×108CFU/mL，按照1.3.2.2中的方法进行抑制率的测定。

1.4 数据处理

试验数据用Excel与Origin软件进行计算作图，SPSS软件进行方差分析和显著性分析。试验结果以平均值(mean)±标准差(SD)表示。

2 结果与分析

2.1 病原菌鉴定

2.1.1 菌落形态

将分离纯化的病原菌置于PDA培养基，28 ℃恒温培养4 d。通过菌落形态观察发现，菌落在PDA平板上大致呈圆形，轮纹状，颜色为灰白色，菌落相对平坦，质地绒毛状或絮状，在菌落边缘形成一圈浓密白色绒毛，边缘轮廓清晰；有菌丝，菌丝无色，边缘整齐；有孢子。

2.1.2 显微形态分析

将病原菌在显微镜下进行显微观察发现，其菌丝壁薄、光滑、致密，呈树枝状，多个分支，分支狭窄；分生孢子芽生，链状排列，椭圆形或卵形；分生孢子梗较短，分枝。

2.1.3 ITS序列测定与构建进化树

将病原菌株标号为HF菌株，利用 ITS通用引物进行 PCR 扩增，并对纯化的PCR产物进行测序，获得了580 bp左右的序列，如图1所示。

将测序结果进行同源性比较和构建系统发育树后发现：病原真菌HF序列在 GenBank 中和Moniliniafructicola有比较高的同源性。从GenBank 数据库中选取代表葡萄孢属不同种的 ITS序列，以核果链核盘菌Monilinialaxa(LT615188.1)、桃褐腐病菌Moniliniafructicola(KM279616.1)与核盘菌Sclerotiniasclerotiorum(MK010971.1)作为外群，构建系统发育树，结果表明，HF菌株与亲缘关系较近的Moniliniafructicola聚于同一支，同源性达到99%(如图2所示)；结合其形态学培养特征，将病原真菌HF鉴定为美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)。

图1 PCR 扩增产物凝胶电泳结果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR amplified products

图2 基于菌株HF的ITS基因序列构建的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree constructed based on the sequence of ITS gene of strain HF

2.1.4 致病性验证

将分离的美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)回接于健康甜樱桃进行致病性实验。结果表明，回接后的甜樱桃果实出现软化，病斑直径逐渐增大，有白色菌丝，直至完全腐败。如图3所示，接种的甜樱桃果实24 h后出现软化，72 h后有明显病斑，120 h后每个果实基本都出现不同程度的病状，发病率100%，发病级别最高达4级，发病症状与自然条件下发病症状相一致，由此证明美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)是造成山东省泰安市“美早”甜樱桃采后褐腐病的病原菌。

a-24 h樱桃发病情况;b-72 h樱桃发病情况;c-120 h樱桃发病情况图3 樱桃发病情况Fig.3 Cherry incidence

2.2 内生拮抗细菌的筛选、鉴定

2.2.1 内生拮抗细菌的分离与筛选

从健康甜樱桃果实上获得有形态差异的细菌19株，菌株编号X-1～X-19。从19株菌株中筛选得到5株对甜樱桃褐腐病具有一定生防作用的细菌。如表4所示，X-16菌株对褐腐病原菌的抑制效果最为明显，病原菌菌落直径最小，直径为(1.74±0.08)cm，抑制率达(72.27±0.55)%。在P<0.05的情况下，每个处理组之间均成显著性差异。

表4 内生拮抗细菌对甜樱桃褐腐病原菌生长的抑制作用Table 4 Inhibition of endophytic antagonistic bacteria on the growth of sweet cherry brown rot pathogen

注：同列不同小写字母表示不同处理组间差异显著(P<0.05)(下同)；-表示无

2.2.2 X-16菌株的形态学鉴定

通过观察，X-16生防菌菌落呈微黄色、形状不规则，不透明；在显微镜下观察到革兰氏染色后菌体呈紫色短杆状，判定X-16菌株为革兰氏阳性菌。

2.2.3 X-16菌株的生理生化特征测定

参照《伯杰细菌鉴定手册》方法，对菌株X-16进行革兰氏染色、吲哚反应、接触酶、柠檬酸盐利用、V-P试验、苯丙氨酸脱氢酶、硝酸盐还原、糖醇发酵(产酸不产气)、水解、耐盐性、生长温度范围、pH等特性检测，菌株X-16与特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)生理生化指标相同(表5)。

2.2.4 X-16菌株的16S rDNA序列鉴定

通过16S rDNA序列鉴定，在GenBank数据库中BLAST比对，并利用MEGA 7.0软件进行聚类分析构建系统发育树，结果显示，菌株X-16与特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)聚类(图4)，同源性为98%，结合形态鉴定和生理生化鉴定结果，最终鉴定 X-16为特基拉芽孢杆菌(B.tequilensis)。

表5 菌株X-16生理生化分析结果Table 5 Physiological and biochemical analysis results of strain X-16

注：+表示有该特征或可利用该物质，-表示不具有该特征或不利用该物质

图4 基于菌株X-16的16S rDNA基因序列构建的系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA gene sequence of strain X-16

2.3 拮抗菌X-16不同处理液对病原菌的拮抗效果

2.3.1 拮抗菌X-16生长曲线的测定

拮抗菌 X-16在 4 h时进入对数生长期，此时菌体生长速率最快，代谢旺盛；12 h时进入稳定生长期，此时总菌落数最大，代谢物质积累最多，重要的次级代谢产物在此时产生较多；当生长到24 h 之后菌体浊度开始降低，细胞出现凋亡(图5)。

图5 拮抗菌X-16的生长曲线Fig.5 Antagonistic bacteria growth curve of X-16

2.3.2 拮抗菌X-16菌悬液、发酵液、发酵上清液对病原菌的抑制效果

通过对不同处理组病斑直径的测定发现，拮抗菌X-16菌悬液、发酵液和发酵上清液对病原菌的抑制效果不同(表6)。菌悬液(1×108CFU/mL)与对照组无显著性差异，对褐腐病病原菌抑菌效果不明显，而发酵液(1×108CFU/mL)和发酵上清液抑菌效果显著(P<0.05)，抑菌率达到(71.93±0.18)%和(67.14±0.43)%。

表6 菌株X-16的菌悬液、发酵液、发酵上清液对病原菌的抑制效果Table 6 The effect of suppressing X-16 strain of the bacterial suspension, a fermentation broth, the fermentation supernatant pathogen

3 结论

对腐败“美早”甜樱桃样品进行采后致病菌分离纯化，通过形态学观察、分子生物学技术与回接实验，发现其发病特征与腐败樱桃发病特征一致，因此造成山东泰安地区“美早”甜樱桃褐腐病的主要病原菌为美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)，这与MENG等[32]和尹良芬[34]报道的核果/仁果类褐腐病菌结果相一致，而周芳[33]在研究山西省褐腐病菌种群时发现美澳型核果褐腐病菌(Moniliniafructicola)不是最主要的致病菌株，因此不同地区甜樱桃褐腐病菌种群之间存在差异，需进一步探索褐腐病菌种群的遗传多样性，为不同地区核果/仁果类果实褐腐病的有效防治提供理论依据。

生防菌株的研发与应用对防止果蔬微生物病害具有重要意义。目前对特基拉芽孢杆菌的生防作用已有较多研究，谢洁等[35]研究表明特基拉芽孢杆菌对桑椹菌核病有较好抗性；GHOLAMI等[36]发现特基拉芽孢杆菌对大豆炭疽病具有一定拮抗效果；此外，特基拉芽孢杆菌对蓝莓根霉病[37]、马铃薯黄萎病[38]也有一定防治效果。但国内外对于特基拉芽孢杆菌作为生防菌作用于甜樱桃病害的防治缺乏相关研究，本研究从甜樱桃本身筛到5株内生拮抗细菌，通过平板对峙选出抑菌效果最好的X-16，菌株鉴定为特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis)，抑制率达(72.27±0.55)%，有较明显的拮抗作用，填补了甜樱桃褐腐病生物防治的空白，实际防治效果还需进一步大田试验验证。

特基拉芽孢杆菌所需营养简单，生长繁殖能力快，防治效果好，具有成为优势生防菌株的潜力。SINGH等[39]研究发现，特基拉芽孢杆菌可通过产生脂肽类或生物表面活性剂等破坏病原菌的生物膜，从而发挥抑菌作用。体外拮抗实验表明，菌株X-16的发酵液与发酵上清液抑菌效果显著，抑制率分别达(71.93±0.18)%和(67.14±0.43)%(P<0.05)，这可能与发酵液和发酵上清液中均含有抑菌活性的胞外分泌物有关，但发挥作用的抑菌活性成分及相关抑菌机理尚不明确，因此本实验室会进一步研究抑菌活性成分的提取、纯化及毒性检测，为特基拉芽孢杆菌的生防利用奠定实验基础。