猪冷冻精液生产技术标准与规范及相关问题解读

张树山，张德福*，韩雪峻，姜红菊

（1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程研究室，上海 201106；3.上海祥欣畜禽有限公司/上海种猪工程技术研究中心，上海 2013021）

1 背景

优秀种公猪在猪育种和生猪商品化生产中的作用至关重要，而猪冷冻精液保存技术正是让其实现种用价值倍增的有效手段之一。然而，与牛精液相比，猪精液量大、精子对“冷休克”较敏感等特性，多年来一直制约着猪精液冷冻保存技术的发展。此外，作为多胎家畜，猪冷冻精液使用效果的评价指标除受胎率外还有窝产仔数，这也是猪冷冻精液推广应用难度较大的原因。近10年来，研究者们已摸索出一套针对猪精液和精子特性的冷冻工艺，在冷冻稀释液研发方面也取得了较大进展；可精准控制降温的精子冷冻仪、猪精液自动分装等仪器的问世和应用，结合母猪深部输精技术等，使猪冷冻精液的商业化生产和应用成为可能。

自2009年起，随着全国性的猪遗传改良计划的全面实施，政府通过国家生猪良种补贴项目加强国家生猪核心育种场、种公猪站建设，有力地推动了国内育种和生产企业单位从种公猪的活体引种，向根据自身需求订制种猪精液（液态保存和冷冻精液）转变。近两年非洲猪瘟疫情的惨痛教训，使业内人士开始意识到，与引进种公猪和订制液态保存精液相比，猪冷冻精液可使种公猪遗传资源突破时空限制，并具有更高的生物安全性。目前，国内多家知名猪育种企业十分重视冷冻精液商业化生产和销售，市场前景十分看好。

“不以规矩，不成方圆”，出自《孟子》。技术标准/规范是一种规定产品、过程或服务应满足技术要求的文件，一般认为规范的强制性弱于标准。技术标准的制订已经成为产业特别是高技术产业竞争的制高点。当今知识经济时代，在一些高技术产业领域已由过去的“先有产品后有标准”向“标准先行”转变。在家畜冷冻精液中，牛冷冻精液是最早实现商业化生产和销售的，我国至今已有4个国家和地方标准。猪冷冻精液标准化的商业生产也应有生产标准来规范，但目前能公开检索到的相关生产技术标准仅有一个（DB13/T 2633-2017 猪冷冻精液，河北省）。文章对公开发表和正在修订的2个猪冷冻精液生产标准/规范（种猪冷冻精液，国家标准，修订中；猪冷冻精液生产技术规范，上海市，修订中）逐条进行解读和探讨，以期为相关管理和生产人员能更好地学习和理解生产标准，从而推动猪冷冻精液的商业化进程。同时，标准修订者也能从生产一线人员及时得到反馈意见，以便进一步提高标准的先进性、科学性、合理性和可操作性。

2 猪冻精制作标准与规范要点梳理与解读

2.1 使用范围

文章涉及的3个标准/规范主要针对种猪冷冻精液的商业化生产，不适合用于地方猪品种遗传资源保存。

我国地方猪品种群体规模较小、甚至部分品种濒临灭绝，少量的公猪显得尤为珍贵，故地方猪品种保种对公猪个体、细管冷冻精液密度、解冻精液品质（活力、顶体完整性等）等指标远低于商业化冻精的生产。

2.2 相关术语（猪精液品质检测指标）

猪精液品质检测指标及相关术语如表1。

序号为1～3的指标均可以利用计算机辅助分析（Computer aided sperm analyse，CASA）系统进行检测。该系统能通过跟踪精子运动轨迹测定精子运动速率，并自动分析精子活力和活率指标；精子畸形率则由计算机自动识别精子再由人工评定分类，最后分析畸形精子百分率（畸形精子包括头部、体部和尾部畸形或缺失等）。

精子活力和活率这两个指标主要用于评价精子运动性能，二者仅有一字之差，容易混淆。目前，业内人士已约定俗成，精子活力指直线运动精子百分率；精子活率指活精子百分率，可以由CASA系统分析（通过判断精子运动情况）或染色方法鉴定。

高品质的猪冷冻精液，意味着解冻后精子具有较好的运动性能（评价指标为精子活力）和顶体完整性。精子活力较高的解冻精液，能够使部分精子到达受精部位；到达受精部位的精子还需要有较完整的顶体才有较好的穿卵能力（即受精能力）。故精子顶体完整性是评价解冻精子受精能力的一个重要指标。通常采用FITC-PNA染色法在荧光显微镜下分析。

2.3 种公猪和原精液要求

种猪来源于具有较好的种用价值，体型外貌和生产性能等符合种用要求、三代系谱资料齐全、体质健康，不患有国家或农业农村部已发布的动物防疫法中所明确的二类疾病的种猪。

由于猪精子耐冻性具有较明显的个体差异性，通过猪精子耐冻性试验筛选（即对所有公猪精液进行冷冻，通过检测其解冻活力、顶体完整性和畸形率等指标评定）的公猪用于制作猪冷冻精液，具有高育种价值的种公猪可降低筛选标准（如解冻后精子活力、精子畸形率和顶体完整性）。

原精液色泽为灰白色或乳白色，精子活力≥70 %，精子密度≥2.0h108个/mL，精子畸形率≤5 %。

表1 相关术语和猪精液品质检测指标

2.4 猪冷冻精液质量要求

表2为种猪冷冻精液质量要求。

解冻后的冷冻细管上的标记应该清晰易识别、信息齐全，与小布袋或贮精管上标记一致。将猪解冻精液推入解冻液后，将排空细管与解冻精液一一对应、整齐摆放，以便后面信息记录。

如果解冻过程中有水进入解冻精液，会对精子产生渗透压损伤，故解冻时发现细管有破损应即弃掉。

猪冷冻精液剂型主要有0.5、1.0和5.0 mL细管三种。普遍认为，细管剂型越大（即体积越大），细管内不同部位猪精液冷冻降温和解冻升温速率较低且差异越大，精子的冷冻效果不如小剂型。其优点是体积大、有效精子数多，解冻效率相对较高。目前，在猪冷冻精液商业化生产的精液灌装、封口等自动化生产设备绝大多数是生产0.5 mL剂型的。但0.5 mL剂型的问题是单根细管内有效精子数相对较少，解冻较繁琐（每头母猪单次输精需解冻0.5 mL细管冷冻精液4～8支）。

精子活力，指猪解冻精液在水浴锅静置20 min后，利用CASA系统进行分析，取三次检测均值（允许误差不能大于均值的5%）。

前向运动精子数（即有效精子数目）=细管体积h精液密度h精子活力。

精子畸形率采用姬姆萨染色法，在显微镜（400～600倍）下观察，并用血球分离计数器计数，每个抹片观察200个以上的精子（分左、右2个区），取2抹片的平均值（变异系数不得大于20%）。

精子顶体完整率采用FITCPNA荧光染色后，在400h荧光显微镜下（激发波长480 nm、发射波长530 nm紫外光）观察并计数200个以上精子，并统计顶体完整精子数量并计算百分率（重复2次，允许误差不能大于均值的5%）。

细菌含量是家畜冷冻精液的一个重要品质指标，对猪冷冻精液的使用效果和母猪生殖系统的健康均有重要影响作用。采用公猪自动采精系统、保持猪冷冻精液生产场地清洁、加强器皿和稀释液灭菌等均可明显降低猪冷冻精液中的细菌含量。猪冷冻精液细菌含量检测，通过对猪解冻精液接菌、培养和细菌菌落计数，1 mL猪解冻精液中细菌菌落数量≤1 000个为合格产品。随着猪精液冷冻技术的进步，未来的标准修订会逐步提高精液中的细菌含量标准。

非洲猪瘟病毒、口蹄疫病毒、猪瘟病毒、高致病性猪蓝耳病病毒、猪圆环病毒、猪细小病毒和布鲁氏菌等7种病毒相关国家/行业标准，采用试剂盒的方法检测（也可采用采精种公猪个体定期检测结果），病原学检测均为阴性即合格。

上述指标在每批次产品入库前和销售前各检测一次（或每隔半年一次）。

2.5 取样

2.5.1 生产方取样

按照GB/T 2828.2，采用极限质量LQ=8.0，模式A一次抽样方案，确定取样种猪样品量。

采用极限质量LQ=8.0，如表3所示，细管冷冻精液数量在151～280支时，抽检28支全部达标即为合格产品；数量在3 201～10 000支时，抽检125支，不达标数量≤5时为合格产品。

2.5.2 质量监督取样

按照GB/T 2828.11，该群体种猪为一监督总体，采用声称质量水平（DQL）=10，选用第Ⅰ检验水平的抽样方案，确定取样种猪样品量（见表4）。

表2 种猪冷冻精液质量要求

声称质量水平（DQL）=10，若细管冷冻精液数量在90～100支之间时，取样数量为4支；若细管冷冻精液数量在150～170支之间时，取样数量为7支。

2.6 猪冷冻精液细管的包装和贮存

包装应在液氮或-140℃以下的环境中进行。将检验合格的冷冻细管采用手工或半自动仪器装入贮精管，包装后的细管冷冻精液，其棉塞端应朝向贮精管的底部。再将装有猪冷冻精液细管的贮精管移至灭菌纱布袋（一般每个纱布袋装同1头公猪的冷冻精液细管），同一天的多个纱布袋的封口绳分别拉紧、用另外一根绳扎在一起后浸入液氮中，棉绳上端贴好标签拴到液氮罐提手处（图1、图2左，即“贮精管 纱布袋 细绳”法）。采用“贮精管 纱布袋 细绳”法的缺点是，不同纱布袋的系绳容易缠到一起不容易取出。种猪冷冻精液应贮存于装有液氮的容器。在由一个容器转移至另一容器时，在空气中的滞留时间不得超过3 s。

国外也有采用“贮精管 贮精筒 提漏”方法的情况，即将装满冷冻细管的贮精管收集至大号贮精筒、移至敞口液氮罐中的提漏中保存（图2右）。这种保存方法取放、解冻方便，值得有条件的生产企业借鉴。

保存猪冷冻精液的液氮罐由专人负责维护和液氮添加，并做好液氮添加记录。

猪冷冻精液信息标记主要在冷冻细管封口一端（使用细管打印机）、纱布袋上和液氮罐口系绳末端（见图3。使用记号笔标记、粘贴打印标签或二维码）。液氮罐边放置猪冷冻精液记录本，记录生产日期、生产者与质检员姓名、生产厂家地址与联系方式、公猪号、液氮罐标号、冷冻细管数量，移出和移入均有记录，并将记录输入电子数据库。

2.7 猪冷冻精液的运输

运输过程中贮存容器不得碰撞或剧烈震动。液氮罐外的明显位置标记“向上”、“小心轻放”等储运图示标志；搬运、装车时应该注意罐体防护，不得倾斜、横倒、碰撞和强烈振动，确保猪冷冻精液始终浸泡在液氮中；随罐附带记录一份并将电子版发给客户。

表3 模式A 一次抽样方案（主表）

表4 第Ⅰ检验水平的抽样方案表（L=1）

图1 放置冷冻细管的贮精管（左），用记号笔标明简单信息；带有系绳的纱布袋（右）

图2 国内使用的“贮精管—纱布袋—细绳”法（左）和国外使用“贮精管—贮精筒—提漏”法保存细管冷冻精液（右）

图3 有打印信息的细管（左）；纱布袋系绳末端有彩色打印的标签，有生产日期、猪耳号等信息（右）

3 展望

猪冷冻精液是继牛冷冻精液之后第二个实现商业化生产和销售的家畜精液品种，规模化、商业化的生产迫切需要相关标准来规范。文章解读的3个标准/规范均是由科研院所和生产企业联合制定，并广泛征求意见和修改，具有较高的先进性、科学性、合理性和可行性。随着猪冷冻精液相关标准相继颁布，必将发挥引领和带动作用，从而推动“猪冷冻精液商业化生产 销售 技术服务”这一体系健康、飞速发展。同时，相关标准也需要从科研活动、生产、使用等环节不断得到反馈、修订，尤其要注意借鉴欧盟、美国等畜牧业发达国家的先进经验。