新疆一枝蒿药材双波长HPLC指纹图谱的研究

张逸凡，鲍凤霞，夏振江，尚 靖**

(1中国药科大学中药学院，南京 211198；2南京大学环境学院,污染控制与资源化研究国家重点实验室，南京 210023)

新疆一枝蒿是菊科蒿属植物岩蒿ArtemisiarupestrisL.的全草，是新疆特有的一到多年生药用草本植物，主要分布于新疆天山、阿尔泰山等地区，具有清热解毒、抗过敏[1]、抗病毒[2]、以及抗肿瘤多方面药理作用，用于治疗感冒发烧、腹胃胀痛、肝炎、荨麻疹、过敏性疾病等[3]，是新疆维吾尔族医学传统用药。我国清代赵学敏《本草纲目拾遗》中早有记载[4]，并收载于《药品标准》维吾尔药分册和《维吾尔药志(上册)》[5]，而目前新疆一枝蒿在中国药典中并无收录。在卫生部药品标准中药材第一册(1992)中仅规定其来源、性状、鉴别等，存在质量控制标准缺失的问题。

新疆一枝蒿化学成分的研究始于20世纪80年代，其生物活性成分极其复杂，且用不同方法提取得到的主成分和含量均有较大的差异，目前已报道的从新疆一枝蒿中提取的化学成分主要包括萜类、黄酮及酮酸类、多糖、挥发油、氨基酸等[6-7]。一枝蒿酮酸是从新疆一枝蒿中分离得到的一种结构独特的倍半萜,是其特征化合物之一,在新疆一枝蒿中占约1%的含量[8]。但由于地理条件、气候和生态环境的不同，新疆一枝蒿中有效成分存在差异，仅用性状、理化鉴别以及个别有效成分含量的测定并不能准确评价药材质量[9]。

贺飞等[10]在不同波长下对新疆一枝蒿的指纹图谱进行了研究比较，发现在245 nm波长条件下其分离效果较好。但由于其有效成分等最大吸收波长不一致，建立单一波长下的HPLC指纹图谱难以对新疆一枝蒿成分进行整体表达和全面评价。

本研究收集了9批新疆一枝蒿药材，同时运用HPLC-DAD技术建立了2种波长条件下的HPLC指纹图谱，完善了新疆一枝蒿药材的鉴别和质量控制，可为建立更加规范的药材质量标准提供参考。

1 材 料

1.1 对照品与试剂

对照品槲皮素(批号：100081-201610，含量以99.1%计)、绿原酸(批号：110753-201716，含量以99.3%计)、木犀草素(批号：111520-201605，含量以99.6%计)、芹菜素(批号：111901-201603，含量以99.2%计)、紫花牡荆素(批号：111554-201705，含量以98.3%计)均购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙醇、乙腈为色谱纯，其他试剂均为市售分析纯。

1.2 药 材

新疆一枝蒿药材购自新疆，由新疆维吾尔自治区药物研究所何江副研究员鉴定为新疆一枝蒿ArtemisiarupestrisL.的干燥全草，共9批，分别编号为样品S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7、S8、S9。产地和采购时间见表1。

Table1 Sources ofArtemisiarupetrisL.

1.3 仪 器

1260 Infinity高效液相色谱仪(美国安捷伦科技有限公司)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；BSA1245电子天平(北京赛多利斯有限公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；KH-500DB超声波清洗器(昆山禾创超声仪器公司)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取新疆一枝蒿药材于50 ℃下干燥4 h，粉碎、过筛60目。取粉末25 g，精密称量。加入甲醇100 mL，于70 ℃下沸腾回流提取1 h。过滤，残渣用少量甲醇洗涤2次。置于旋转蒸发仪上挥干溶剂，加入甲醇溶液并定容至50 mL。摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，滤液即为新疆一枝蒿检测用供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别取槲皮素、绿原酸、木犀草素、芹菜素、紫花牡荆素对照品适量，精密称量，加甲醇溶解并定容，配制成质量浓度分别为0.89，0.55，0.60，0.62，0.44 mg/mL的对照品溶液，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液备用。

2.2 色谱条件

Zorbax SB-C18色谱柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；甲醇流动相A，0.2%甲酸水流动相B，线性梯度洗脱(A∶B)，0 min(30∶70)～40 min(70∶30)～55 min(80∶20)～65 min(100∶0)；流速1.0 mL/min；柱温：32 ℃；进样量：20 μL；检测波长：245和325 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度 取新疆一枝蒿药材，按“2.1.1”项下方法配制试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样5次，记录色谱图。在245 nm处，识别各共有峰，并计算与参照峰(槲皮素)的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD分别为0.02%～0.10%和0.10%～1.53%。在325 nm处，识别各共有峰，并计算与参照峰(绿原酸)的相对保留时间和相对峰面积，结果RSD分别为0.03%～0.07%和3.00%～4.05%。结果表明本方法具有较好的精密度。

2.3.2 重复性 取同一批次药材样品，按“2.1.1”项下方法配制试品溶液，平行制备5份，按“2.2”项下色谱条件连续进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以及与相应对照色谱峰的相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD。在245 nm处，各共有峰与参照峰(槲皮素)的相对保留时间RSD的范围是0.09%～0.50%，相对峰面积RSD的范围是0.43%～2.46%。在325 nm处，各共有峰与参照峰(绿原酸)的相对保留时间RSD的范围是0.10%～0.43%，相对峰面积RSD的范围是1.43%～2.71%。结果表明，RSD均小于3.00%，重复性良好。

2.3.3 稳定性 取同一批次样品，按“2.1.1”项下方法配制试品溶液，分别在0，2，4，8，16，24 h按“2.2”项下色谱条件连续进样，记录各共有色谱峰保留时间和积分面积，以色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD。在245 nm处，各共有峰与参照峰(槲皮素)的相对保留时间RSD的范围是0.01%～0.4%，相对峰面积RSD的范围是1%～3%。在325 nm处，各共有峰与参照峰(绿原酸)的相对保留时间RSD的范围是0.09%～0.90%，相对峰面积RSD的范围是1.95%～2.87%。结果表明，制备样品稳定性较好，常温下24 h内能保持较好的稳定性。

2.4 新疆一枝蒿双波长指纹图谱建立

2.4.1 指纹图谱的建立及相似度评价 取9批次新疆一枝蒿药材按“2.1.1”项下方法配制试品溶液，按“2.2”项下色谱条件测定，得到9批新疆一枝蒿药材高效液相色谱图。将9批次新疆一枝蒿药材的高效液相色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2.0版》(国家药典委员会)，以S1为参照指纹图谱，经多点矫正，采用中位数的方法，得到新疆一枝蒿色谱对照指纹图谱(图1)，以对照图谱为参照，在峰位匹配的基础上，采用夹角余弦法对待测样品图谱之间以及与对照指纹图谱间进行相似度计算，9批新疆一枝蒿样品指纹图谱的相似度大于0.9，相似性良好。

Figure1 HPLC fingerprints of 9 batches ofArtemisiarupestrisL.at (A) 245 and (B) 325 nm

2.4.2 特征指纹峰的标定及确认 以对照图谱为参照，按照峰面积大小，在245 nm处取前7列峰，在325 nm处取前8列峰标定为共有峰。计算各共有指纹峰的相对保留时间和相对峰面积。在245 nm时，相对保留时间RSD的范围是0.1%～1.3%，相对峰面积RSD的范围是1.9%～3.4%。在325 nm时，相对保留时间RSD的范围是0.6%～1.6%，相对峰面积RSD的范围是2.5%～3.8%。各共有峰稳定，具有指纹图谱的特征性。取对照品按将“2.1.2”项下方法配制对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进行检测，得到对照品高效液相色谱图(图2)，与对照图谱相比对，指认出槲皮素、绿原酸、木犀草素、芹菜素、蔓荆子素5个峰。

3 讨 论

3.1 检测波长的选择

本研究对新疆一枝蒿在紫外可见范围下进行全波长扫描并进行考察，药材样品在325 nm处有最大吸收，并根据此前文献报道，新疆一枝蒿指纹图谱常用波长为245 nm，因此本实验最终确定波长为245和325 nm，在这两个波长下对新疆一枝蒿进行综合的质量评价。

Figure2 Comparison fingerprint ofArtemisiarupestrisL at (A) 245 nm and (B) 325 nm

2：Quercetin；8：Chlorogenic acid；11：Luteolin；12：Apigenin；13：Casticin

3.2 流动相的选择

本实验在245和325 nm波长下，分别对3种流动相系统进行考察，结果见图3，甲醇-0.2%甲酸水的分离效果最好，基线平稳，出峰较多，故选用该流动相为洗脱条件。

3.3 色谱柱选择

不同品牌规格的色谱柱因柱料填充、键合条件等因素会在性能上存在不同，导致指纹图谱存在差异，本实验中，考察Agilent C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)和Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)两个不同厂家色谱柱，比较指纹图谱的差异。采用同一供试品溶液，依次使用不同的色谱柱，进样，记录保留时间和峰面积，在245和325 nm波长条件下，Agilent C18的柱效均大于Diamonsil C18，并结合目标成分峰的拖尾因子等多因素进行评价，最终选定Agilent C18色谱柱。

4 结 论

中药指纹图谱是目前符合中药特色的评价中药真实性、稳定性和一致性的质量控制手段之一。本实验通过在245和325 nm双波长条件下对9批药材进行指纹图谱的研究，弥补了单一波长下对质量控制不全面的弊端。在色谱条件的优化中，对流动相、色谱柱等洗脱条件进行不同的考察，最终确定稳定的系统条件，为指纹图谱的建立奠定基础。新疆一枝蒿内主要药效成分以黄酮及酮酸类化合物为主，在对照品选择上，本实验分别在245和325 nm下以槲皮素和绿原酸为对照，廉价且易于获得，符合一测多评的选择原则。以相似度评价系统对9批药材的指纹图谱进行计算模拟，得到新疆一枝蒿对照图谱并进行相似度评价，进一步对所建立的指纹图谱进行特征峰的标定，分别在245和325 nm得到7个和8个共有峰，并确认了槲皮素、绿原酸[11]、木犀草素、芹菜素、紫花牡荆素5个峰，且共有峰稳定，所建立指纹图谱能够作为新疆一枝蒿质量控制的评价标准。

Figure3 HPLC ofArtemisiarupestrisL.with different mobile phase at (A) 245 nm and (B) 325 nm

1：Methanol-water；2：Methanol-0.2% formic acid-water；3：Acetonitrile-water