不同温度下椰汁中金黄色葡萄球菌的生长动力学模型比较

郭明娟， 光翠娥*，， 干建平， 范志文

（1. 食品科学与技术国家重点实验室，江南大学，江苏 无锡214000；2. 黄冈师范学院 经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室& 大别山特色资源开发湖北省协同创新中心，湖北 黄冈438000）

金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属的一种重要病原菌，不仅能引起皮肤感染，还易导致细菌性食物中毒，有“嗜肉菌”之称。 由葡萄球菌引起的食物中毒是由于摄入了含有耐热葡萄球菌肠毒素的食物。在受污染的食品中， 当金黄色葡萄球菌浓度达到106.5CFU/g 时， 这种肠毒素剂量就能达到使人中毒的水平[1]。 如果食物生产和储存期间的环境条件对金黄色葡萄球菌的生长有利，就会产生葡萄球菌肠毒素[2]，对消费者产生危害。 每年因金黄色葡萄球菌引起的中毒事件在世界各地时有发生，中国也不例外。

植物蛋白饮料营养丰富，但也是微生物的大本营，生产若有忽视，则会导致严重质量问题，短期内出现腐败变酸、分层沉底或胀瓶等后果[3]。 椰汁作为一种植物蛋白饮料，汁味清甜，香浓沁爽，富含蛋白质、脂肪、维生素C 及钙、磷、铁、钾、镁、钠等矿物质，是营养极为丰富的饮料[4]。 因此椰汁作为天然的培养基，极易受到微生物污染，适于金黄色葡萄球菌的生长。 2006 年7 月，在法国的法兰西岛爆发了关于椰汁的中毒事件，Hennekinne[5]等人从导致人们中毒的椰汁中分离出了金黄色葡萄球菌。 目前国内外关于金黄色葡萄球菌在食品中的研究涉及肉类[6-8]、乳制品[9-10]、米面制品[11-13]等，但关于金黄色葡萄球菌在椰汁中的研究还没有。

食品中的预测性微生物学是食品微生物学领域的一个研究领域，旨在提供数学模型来预测食品环境中的微生物行为[14]。它主要结合微生物学、工程数学及统计学，通过前期收集大量数据，建立一级和二级模型，结合计算机建立仿真软件，利用软件输入初始条件得出微生物的生长情况，对产品安全进行评估[15]。 预测微生物学的应用主要包括食品的货架期预测、风险评估等。Gompertz、Logistic、Baranyi和Richards 模型[16]等是预测微生物学中常见的一级模型， 常见的二级模型有平方根、Arrhenius 和多项式模型等。 Anderson[17]等人收集了不同温度下（7~30 ℃）沙门氏菌和单增李斯特菌在生菜中的生长参数，构建了温度与生长参数最大比生长速率和延滞期的函数关系。 牛会敏[18]等人检测了低温条件下假单胞菌在冷却猪肉中的生长，发现冷却猪肉中假单胞菌的最适生长模型在不同温度下各不相同，0 ℃时是Baranyi 模型，5 ℃时是修正的Gompertz 模型，10 ℃时是Huang 模型。

本研究的目的是找到一级和二级模型描述椰汁中金黄色葡萄球菌的生长。 以椰汁为原材料，测定不同温度下（20、25、30、36 ℃）椰汁中金黄色葡萄球菌的生长数据， 应用MGompertz 模型、 MLogistic模型和Baranyi 模型拟合出一级生长预测模型， 根据拟合度选取适宜的一级模型，得到最大比生长速率（μmax）和延滞期（tlag）。采用平方根和二次多项式模型建立温度与μmax、温度与tlag关系的二级生长模型，选择最优模型， 并对所得结果进行可靠性验证， 为指导椰汁生产和消费、 控制椰汁腐败提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与材料

金黄色葡萄球菌（CMCC26003）：北纳创联生物技术有限公司；椰汁：椰树集团；Baird-Parker 平板、亚碲酸钾卵黄菌增液：上海谷研实业有限公司。

1.2 仪器与设备

CHP-80 培养箱： 上海市三发科学仪器有限公司；DSX-280B 手提式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；GZX-9070 MBE 电热鼓风干燥箱： 上海博讯实业有限公司医疗设备厂；DK-8D 电热恒温水槽：上海精宏实验设备有限公司；SF-CJ-1A 净化工作台：上海三发科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 不同温度下生长曲线测定 为模拟金黄色葡萄球菌污染椰汁的情况，将适量的菌液接种到椰汁中。 挑取一环金黄色葡萄球菌菌落，浸入装有10 mL 灭菌生理盐水试管中振荡， 制成浓度为107～108CFU/mL 的菌悬液。 对菌悬液稀释一定倍数后，将菌悬液按1∶100 的比例接种到椰汁中， 分别置于20、25、30、36 ℃下培养。 其中30、36 ℃下2 h 取样测量一次，25 ℃下3 h 取样一次，20 ℃下6 h 取样一次。每次吸取10 mL 样品置于装有90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶中振荡，依次进行10 倍稀释。 选取2 个稀释度适宜的样品， 每次吸取两个100 μL 样品加入Baird-Parker 平板中，用涂布棒涂布[19]。 倒置于36 ℃培养箱中培养24～48 h。每个样品做两次重复。1.3.2 金黄色葡萄球菌生长的一级模型 一级模型用于描述微生物数量变化与培养时间的关系，用Matlab 软件分析不同温度条件下金黄色葡萄球菌在椰汁中的生长数据，拟合S 型曲线，建立生长模型。比较3 种模型的拟合指标，选取最佳模型。研究选取预测微生物学最常用的3 种一级预测模型，即MGompertz 模型、MLogistic 模型和Baranyi 模型来拟合不同温度下金黄色葡萄球菌在椰汁中的生长模型。

修正的Gompertz 模型[20]：式中，lg（Nt）为t时刻细菌的对数值；lg（N0）为初始细菌的对数值；lg（Nmax）为最大细菌数的对数值；tlag为延滞期；μmax为最大比生长速率。

1.3.3 金黄色葡萄球菌生长的二级模型 二级模型一般用于描述不同生长环境下环境因子对微生物生长的影响。 根据一级模型获得相关的生长参数μmax和tlag，采用Matlab 软件，利用平方根和二次多项式模型分别拟合温度与μmax和tlag的关系，两种模型的表达式如下。

平方根模型：

式中，b为模型参数；Tmin为最低生长温度。二次多项式模型：

式中，T为实验温度；a、b、c为模型参数。

1.3.4 一级模型可靠性评价 应用Matlab 软件对所得生长数据进行非线性拟合， 采用R2、RMSE、RSS、RSE 和AIC 整体分析3 种模型的拟合效果。R2用于对拟合效果进行总的评价，其值越接近于1，拟合效果越好；RMSE 可衡量预测准确度，说明模型预测值的离散程度；RSS 和RSE 值越小， 拟合效果越好；AIC 是衡量统计模型拟合优良性的一种标准[23]，AIC 值最小的模型是最准确的。 其中：

式中，pred 为用模型拟合出的生长数据，即拟合值；obs 为实际所测得的数据值， 即实测值；n为样本数量；m为模型中参数的个数。

1.3.5 二级模型的评估与验证 采用偏差因子（Bf）和准确因子（Af）来评价二级模型的可靠性。

Af 可测量预测值和实测值之间的准确程度，Af＞1，越接近1，模型准确度越高。

Bf 可判断预测值和实测值之间的偏差度，其值处于0.9～1.05 范围内较好。

2 结果与分析

2.1 一级模型的建立

2.1.1 残差分布 4 个温度下的方程拟合值与实测值的残差见图1。拟合度较好的模型，其残差应呈随机分布[24]。 由图1 可知，4 个温度下3 种模型的残差分布未呈现任何规律，所以3 种模型均对实测值拟合程度较好， 没有系统误差。 但相较于MGompertz和MLogistic 模型，Baranyi 模型的残差值大部分在±0.2 上下来回波动，分布更为集中。

图1 不同温度条件下的残差分布Fig. 1 Plots of residual at different temperatures

2.1.2 曲线拟合 对20、25、30、36 ℃4 个温度下的生长数据进行拟合， 结果见图2。 由图2 可以看出，随着培养时间的延长，金黄色葡萄球菌的浓度也随之增加，且遵循S 型曲线，培养一定时间后都趋于稳定。30、36 ℃下，金黄色葡萄球菌的浓度都达到8 lg（CFU/mL）以上，25 ℃的浓度接近8 lg（CFU/mL），20 ℃的浓度接近7 lg（CFU/mL）。

图2 不同温度条件下拟合曲线Fig. 2 Fitting curves at different temperatures

2.1.3 拟合度统计指标分析 拟合完成后对模型的准确度进行进一步的评估，得出3 种模型的相关拟合度指标，见表1。

表1 反应的是不同温度下3 种模型拟合度指标的分析。可以看出，4 个温度下的拟合效果都比较好，相关系数R2都在0.99 以上。 相较于MGompertz和MLogistic 模型，Baranyi 模型拟合出的相关系数R2最大，R2的平均值达到0.996 1； 均方根误差RMSE 最小， 平均值为0.131 6；RSE 和AIC 的平均值最小，分别为0.145 5 和-36.685 8，拟合效果相对更好。 因而选择Baranyi 模型作为拟合金黄色葡萄球菌在椰汁中生长的一级模型。

根据上述结论，以Baranyi 模型为基础，得到不同温度下椰汁中金黄色葡萄球菌的生长动力学参数，包括初始菌落数N0、最大菌落数Nmax、最大比生长速率μmax和延滞期tlag，见表2。20 ℃下金黄色葡萄球菌生长较慢，最大比生长速率较小，延滞期则较长。 随着温度的升高，最大比生长速率逐渐升高，延滞期则相应缩短。25、30、36 ℃时最大比生长速率分别为20 ℃时的2 倍、3 倍和3.5 倍；20 ℃时延滞期分别为25、 30、36 ℃时的2.5 倍、4 倍和5.7 倍。各温度下一级预测模型方程为：20 ℃：

其中t是以h 为单位的时间。

2.2 二级模型的建立

根据Baranyi 模型拟合出的生长参数， 利用平方根和二次多项式模型，建立温度与最大比生长速率及延滞期之间的二级模型。 表3-4 为两种模型相关拟合指标的比较。

表1 3 种生长动力学模型拟合度的比较与评价Table 1 Comparison and assessment of three growth kinetic models

表2 金黄色葡萄球菌的生长动力学参数Table 2 Growth kinetics parameters of Staphylococcus aureus

表3 最大比生长速率的拟合度指标Table 3 Goodness of fit of μmax

表4 延滞期的拟合度指标Table 4 Goodness of fit of tlag

由表3-4 可知，对于两个生长参数来说，二次多项式模型的相关系数R2更接近1，Af 大于1 且更接近1，Bf 也更接近于1，拟合度相对平方根模型来说更好，所以选择二次多项式模型表达温度与生长参数的关系。用Matlab 软件拟合出的温度与最大比生长速率及延滞期的拟合曲线见图5-6。

图5 最大比生长速率与温度的二级模型拟合图Fig. 5 Fitted μmax and temperature of the secondary model

图6 延滞期与温度的二级模型拟合图Fig. 6 Fitted tlag and temperature of the secondary model

由图5-6 可知，在20~36 ℃范围内，最大比生长速率随温度的升高而升高，延滞期随温度的升高而减小， 方程的相关系数R2分别为0.997 6 和0.978 5，拟合效果良好，说明二次多项式模型能够较好地反映温度与最大比生长速率及延滞期的关系。 因此选择二次多项式模型可作为金黄色葡萄球菌生长的二级模型。

温度与最大比生长速率模型拟合方程为μmax=-0.001 3T2+0.096T-1.255， 温度与延滞期的拟合方程为tlag= 0.110 6T2-7.295T+123.6。

2.3 模型的验证

根据拟合出的二级模型的方程，分别求出28 ℃和33 ℃下金黄色葡萄球菌在椰汁中的生长动力学参数μmax和tlag，将其带入公式（3）得到金黄色葡萄球菌在28 ℃和33 ℃下的生长曲线。 图7 为预测生长曲线与实测生长曲线的对比图，可看出预测模型可以较好地预测金葡菌在椰汁中的生长曲线。

图7 33、28 ℃下的实测值与预测值Fig.7 Growth curves observed and predicted at 33 and 28 ℃

3 结 语

在选取的3 种一级模型中，Baranyi 模型的相关系数R2平均值最高， 达到0.996 1；RMSE、RSE 和AIC 最小， 分别为0.131 6、0.145 5 和-36.685 8，因此Baranyi 可作为描述椰汁中金黄色葡萄球菌生长的一级模型。

环境因素对微生物的生长有着重要的影响，不同温度下金黄色葡萄球菌在椰汁中生长的差异性较大。 在20~36 ℃下，最大比生长速率随温度升高先增大后减小，延滞期则相反。 用二次多项式模型描述金黄色葡萄球菌生长参数的相关系数R2分别为0.997 6、0.978 5， 偏 差 因 子Bf 分 别 为0.999、0.997，准确因子Af 分别为1.044、1.006。 准确度较高，说明二次多项式模型可较好地描述温度与最大比生长速率及延滞期的关系。

根据拟合出的一级模型和二级模型，可以更好地掌控温度对金黄色葡萄球菌在椰汁中生长的影响，为控制椰汁中腐败微生物、引导安全消费提供理论依据。