咖啡果酒发酵菌种筛选及香气成分分析

匡 钰，梁建平，廖留萍，罗 琴，李庆聪，张洪波

（1.云南省德宏热带农业科学研究所，云南瑞丽678600；2.德宏州科技情报研究所，云南芒市678400）

据农业部发展南亚热带作物办公室统计，2017 年云南咖啡种植面积11.8 万hm2，占全国咖啡种植面积的98.43%；咖啡产量14.50 万t，占全国咖啡产量的98.51%。一般加工1 t 咖啡鲜果产生0.5 t 皮渣（包括果皮、果肉），云南咖啡产区每年咖啡鲜果处理产生的皮渣约39.68 万t，产量巨大。咖啡果皮中，糖、蛋白质、纤维素为主要成分，同时还含有多酚类物质、生物碱性等多种成分，成分丰富，如何综合利用加工产生的皮渣提高其附加值受到国内外研究者的关注。国外咖啡果皮的综合利用研究较多，可将咖啡果皮加工成饲料［1］或青贮饲料［2］饲喂动物，利用咖啡果皮发酵生产β-葡萄糖苷酶［3］、单宁酸酶［4］、乳酸［5］、开发鼠李饮料［6］，及制备生物乙醇［7］、生产沼气［8］等。国内有利用咖啡果肉制成饲料饲喂牲畜［9］，提取咖啡果皮中的膳食纤维［10-11］，研究提取咖啡果皮粗提物［12］，利用咖啡果皮发酵制备咖啡果酒［13-17］、咖啡果皮茶［18］。

咖啡果皮中含有苏氨酸、缬氨酸、蛋氨酸等17 种氨基酸以及绿原酸、葫芦巴碱等功能性成分［19］，成分丰富，适宜开发咖啡果皮茶、果酒等产品。本研究旨在利用咖啡果皮发酵出风味典型的咖啡果酒，开发出咖啡果酒产品。实验选用3种酵母菌发酵咖啡果酒，结合果酒酒度、总酯含量、总酸、感官等指标以筛选出适合咖啡果酒发酵的菌种，并对其发酵条件进行优化；同时采用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术联合气相色谱-质谱（GC-MS）法对咖啡果酒的挥发性成分进行分析，为咖啡果酒开发提供理论参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

咖啡果皮，取自云南省德宏热带农业科学研究所咖啡加工厂；AS2.399，AS2.346，购于中科院微生物研究所菌种保藏中心；安琪果酒酵母，湖北安琪酵母股份有限公司。果胶酶，诺维信（中国）生物制剂有限公司；葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂，购于北京陆桥技术股份有限公司；NaOH、无水乙醇、酚酞，购于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

BS210S 型分析天平，北京奥多利斯天平有限公司；SHZ-B 型水浴恒温振荡器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净工作台，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；SPX-250B 型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂；萃取头（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS），美 国Supelco 公 司；毛 细 管 柱VF-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm），美国Varian 公司；GCMS-QP2010 Plus 型气相色谱-质谱联用分析仪，日本岛津公司；PAL System 三合一进样器，瑞士CTC 公司。

1.3 试验设计

咖啡果皮发酵液中分别接种AS2.399、AS2.346、安琪果酒酵母，综合咖啡果酒的理化和感官指标，筛选出适合咖啡果酒发酵的酵母菌。考察初始糖度、酵母菌接种量、发酵温度、发酵时间等单因素条件对酵母菌发酵性能的影响，优化咖啡果酒的发酵条件。对在优化条件下发酵的咖啡果酒进行香气成分分析。

1.4 试验方法

1.4.1 咖啡果皮发酵液制备

取1 000 g 咖啡果皮，以1∶3 的比例加水，添加果胶酶在35℃条件下酶解3 h，过滤，加入白糖对滤液糖度进行调整。加入亚硫酸钠对其灭菌，使咖啡果皮发酵液的SO2浓度达到60 mg/L，静置2 h 后待用。分装在500 mL 三角瓶中，每瓶装液量为200 mL。

1.4.2 菌种制备

（1）AS2.399、AS2.346 菌种制备

活化斜面：葡萄糖1%，蛋白胨0.5%，酵母膏0.3%、麦芽汁0.3%，琼脂2%，115℃灭菌30 min。一级培养基：糖度为10°Be 咖啡果皮酶解液20 mL，置于50 mL 三角瓶中115℃灭菌30 min。接种2 环活化菌种摇匀，于28℃110 r/min 条件下培养12～16 h。二级培养基：糖度为10°Be 咖啡果皮酶解液150 mL，置于500 mL 三角瓶中110℃灭菌30 min。 接种10% 一级培养液摇匀，28℃110 r/min 条件下培养14～16 h。

（2）安琪酵母菌种活化

将安琪果酒酵母溶解在38～40℃含糖2%的温水中，充分溶解后于28℃110 r/min 条件下培养30 min。

1.4.3 咖啡果酒发酵

将活化后的AS2.399、AS2.346、安琪酵母分别接种到初始糖度为25°Be 的发酵液中，在30℃110 r/min 的条件下发酵10 d，比较发酵液的酒精度、总酸、总酯、感官评定等指标，筛选出较适合的发酵菌种。对筛选出的酵母进行发酵条件优化，考察初始糖度、安琪酵母接种量、发酵温度、发酵时间对咖啡果酒的酒度、总酸、总酯含量的影响。

1.4.4 酒精度、糖含量、总酯测定

酒精度测定：GB/T10345-2007 蒸馏法，使用酒精计测定。采用手持糖量计测量咖啡果皮发酵液和发酵结束后的糖含量。总酯测定（以乙酸乙酯计）：GB/T 10345-2007，白酒分析方法。

1.4.5 咖啡果酒挥发性成分分析

取咖啡果酒5 mL 于15 mL 固相微萃取的样品瓶中，加盖密封，60℃下恒温水浴平衡15 min，把老化好的固相微萃取头插入顶空瓶中萃取吸附45 min 后，自动进样，进行GC-MS 分析。进样口温度250℃，解吸5 min。气相色谱（GC）条件：毛细管柱VF-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升温：初始温度45℃，保留2 min，以5℃/min 的速率升至180℃，再以20℃/min 的速率升至240℃，保留2 min；进样口温度250℃；载气高纯度氦气（He），流速1.08 mL/min；无分流进样。质谱（MS）条件：电子电离（electron ionization，EI）源，电子能力70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，全扫描模式，扫描范围35～500 m/z，溶剂延迟3.5 min。质谱结果经Wiley.lib 数据库和美国国家标准技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）14.lib 谱库检索，对于匹配度大于90 的化合物进行分析，采用峰面积归一化法计算相对含量。

表1 3种菌种发酵咖啡果酒的理化指标及感官比较

1.5 数据分析

采用Microsoft Excel 2010 软件进行数据处理和数据图绘制。

2 结果与分析

2.1 咖啡果酒发酵菌种比较

果酒酿造过程中，酵母菌对酒的品质至关重要。能进行发酵产酒的微生物品种繁多，性能各异。本实验采用安琪果酒酵母、酵母菌AS2.346以及生香酵母AS2.399 来发酵咖啡果酒，对3 种菌种发酵过程中的残糖变化、酒精度变化及果酒理化指标和感官进行了比较，结果见图1、图2、表1。可以看出，安琪果酒酵母产酒能力、产酒速率优于AS2.346、AS2.399，发酵10 d，安琪果酒酵母酒 度 达 到10.8° ，AS2.399 发 酵 酒 度 为8.1° ，AS2.346 发酵酒度为9.2°（图1）；安琪果酒酵母起酵快，糖的利用率高于AS2.346、AS2.399，发酵过程中的糖度降低速率也较平缓（图2），有利于发酵的正常进行。3 种菌种发酵出的咖啡果酒均呈琥珀色，具有咖啡果酒应有的色泽。AS2.399 发酵果酒气味柔和，酒体滋味平淡；AS2.346 发酵果酒酒体滋味偏薄，整体协调性欠佳；安琪果酒酵母发酵的咖啡果酒酒体滋味饱满，酒味浓郁，香味稍薄。综合比较，选择安琪果酒酵母作为咖啡果酒发酵菌种。

2.2 安琪酵母咖啡果酒发酵单因素影响分析

2.2.1 初始糖度

将咖啡果皮发酵液的初始糖度分别调整至15、20、25、30、35°Be，接 种 安 琪 果 酒 酵 母200 mg/L，在28℃条件发酵7 d，测发酵液的总酸、总酯、酒精度，结果如图3 所示。实验结果（图3）表明，随着糖度的增加，总酸、总酯、酒精度的含量随之增加，当糖度达到25°Be 时，总酯含量和酒精度达到最大。初始糖度越高，酒精度越高。当初始糖度为25%时，酒精度达到最大。随着糖度增加，发酵液酒精度下降，总酯含量随着增加，糖度达到30°Be 时最大，之后随之下降；总酸含量出现波动。当糖含量过高时，渗透压抑制了酵母菌的生长和繁殖，由糖转变为酒精较少，酒度降低。因此，选择25°Be 为最适发酵初始糖含量。

2.2.2 发酵温度

将咖啡果皮发酵液的初始糖度调整至25°Be，接种安琪果酒酵母200 mg/L，在20、24、28、32、36℃条件发酵7 d，测发酵液的总酸、总酯、酒精度，结果如图4 所示。

发酵温度为28℃时，酒精度达到最高，温度再高则酒精度下降。温度较低（20℃）时，酵母菌细胞新陈代谢活动减弱，繁殖速度较慢，酒精体积分数较低，但是有利于酵母菌产酯，总酯含量最高；而发酵温度过高时，酵母菌快速繁殖，大量消耗发酵液中糖分，导致用于发酵产生酒精的底物不足，不利于酒精的产生，也使总酯、总酸含量减少，果酒品质下降。因此，确定较佳发酵温度为28℃。

2.2.3 酵母菌接种量

将咖啡果皮发酵液的初始糖度调整至25°Be，分别接种安琪果酒酵母100、200、300、400、500、600 mg/L，在28℃条件发酵7 d，测发酵液的总酸、总酯、酒精度，结果如图5 所示。当酵母添加量低于200 mg/L 时，发酵液酒度随酵母添加量的增加而增大，总酯、总酸含量也增加，当酵母接种量大于300 mg/L 时，酒精度、总酯含量开始下降；当接种酵母的量过大时，短时间内酵母菌快速大量繁殖，导致发酵液中的糖被消耗掉，转化为酒精的少，酒精度降低，同时总酯含量也降低。因此，选择酵母菌最适添加量为200 mg/L。

2.2.4 发酵时间

将咖啡果皮发酵液的初始糖度调整至25°Be，接种安琪果酒酵母200 mg/L，在28℃条件发酵4、5、6、7、8 d，测发酵液的总酸、总酯、酒精度，结果如图6 所示。

表2 咖啡果酒挥发性成分化合物GC-MS分析结果

由图6 可以看出，随着发酵时间的增加，发酵液酒精度、总酸含量、总酯含量增加，发酵第3～7 d 为主发酵阶段，产酒量快速增加，总酸、总酯大幅增加，7 d 后增加平缓，待发酵结束，酒精体积分数达到12.1°。故选择发酵时间为7 d。

综上，安琪果酒酵母发酵咖啡果酒的最佳条件为：初始糖度25°Be，发酵温度28℃，酵母菌接种量200 mg/L，发酵时间7 d。在优化条件下进行咖啡果酒发酵试验，测得咖啡果酒酒度为12°，总酸含量1.42 g/L，总酯2.37 g/L。发酵出的咖啡果酒酒体呈琥珀色，酒味浓郁，香味尚可。

2.3 咖啡果酒挥发性成分分析

检测分析结果（表2）显示，咖啡果酒中能检测到有保留时间和峰面积的挥发性成分100 种，其中SI≥90 的有29 种，占总检出发挥性成分的79.53%，主要为醇类、酸类、酯类，以及少量的醛类、烃类和酮类挥发性成分，其中醇类58.58%、酸类37.23%、酯类3.57%、醛类0.3%、烃类0.23%、酮类0.1%，酯类、醇类挥发性成分占总挥发性成分的95.81%。相对含量较大的成分有10 种，分别为：苯乙醇29.11%、油酸15.05%、异戊醇13.76%、n-棕榈酸10.39%、亚麻酸8.98%、[R-（R*，R*）]-2，3-丁二醇9.95%、二甲基硅烷二醇4.71%、二十烷酸2.25%、丁二酸二乙酯2.2%、γ-丁内酯0.87%。

咖啡果酒挥发性成分中，醇类所占比例最大。其中，苯乙醇是咖啡果酒中相对含量最高、主要的挥发性香味成分，赋予了咖啡果酒淡雅细腻的玫瑰香味。苯乙醇是一种比较典型的芳香醇［20］，阈值为10 mg/L，具有独特的丁香、茴香、独特的紫罗兰香以及淡雅细腻的玫瑰花香，是发酵酒中主要的醇类物质［21］。异戊醇（5.72%）具有苹果白兰地香气，也是发酵酒普遍存在的醇类物质。在白酒中，酸类是形成白酒口味的重要物质，适量的酸类化合物能够增强酒的甜味感，消 除酒的苦味［22］。咖啡果酒中油酸含量最高（15.05%），其次是n-棕榈酸、亚麻酸、二十烷酸、辛酸、异戊酸、异丁酸。挥发性酸类成分中，高级脂肪酸含量高，辛酸具有草香、果香、花香和酒香。

咖啡果酒挥发性成分中的酯类相对含量为3.57%，最多的为丁二酸二乙酯。丁二酸二乙酯有愉快的芳香味、酒味。咖啡果酒挥发性成分中除了醇类、酸类、酯类，还有少量的醛类、烃类和酮类物质。醛类物质中壬醛具有油脂气味和甜橙气息；癸醛具微甜，有果香以及玫瑰气味。

3 结论

本实验通过对比AS2.399、AS2.346、安琪果酒酵母发酵的咖啡果酒的酒度、总酯含量、总酸、感官等指标，筛选出安琪酵母作为咖啡果酒发酵酵母菌，条件优化得到其发酵最佳条件为：初始糖度25° Be，发 酵 温 度28℃，酵 母 菌 接 种 量200 mg/L，发酵时间7 d，发酵的咖啡果酒酒度为12°，总酸含量1.42 g/L，总酯2.37 g/L。检测分析到咖啡果酒的29 种主要挥发性成分，主要包括醇类、酸类、酯类，以及少量的醛类、烃类和酮类。与胡荣锁［16］报道的单菌发酵对咖啡果酒风味影响结果相比较，安琪酵母发酵的咖啡果酒酒度要高，但是果酒风味成分差异较大，风味成分中酯类含量高，其次为醇类，还有少量的醛类、酸类和酮类。存在的差异源于所选的酵母不同，代谢产物也不尽相同。