东北红松蘑多糖提取及抗氧化活性研究

金志民 柴军红 何婷婷

摘要：为研究东北牡丹江地区红松蘑（Gomphidius rutilus）多糖抗氧化活性，采用水提-醇沉法从东北产红松蘑中提取子实体多糖，体外抗氧化模型研究其抗氧化能力，红外光谱研究其多糖基本结构。结果表明，其多糖浓度在1 mg/mL时对超氧离子自由基（·O2-）的清除率为96.96%;多糖浓度在1 mg/mL时对羟基自由基（·OH）的清除率为94.95%;多糖对DPPH自由基的清除率最高为48.53%，其红外表征显示多糖为β-型吡喃多糖。这说明红松蘑多糖抗氧化活性高，有一定的开发价值及前景。

关键词：红松蘑（Gomphidius rutilus）;多糖;抗氧化;红外光谱

中图分类号：R285.5         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）01-0123-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.01.027           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： The antioxidant activity of polysaccharide which extracted from Gomphidius rutilus was studied by. in vitro antioxidant systems. The structure of the extracted polysaccharide was also studied by infrared spectroscopy. The results showed that when the polysaccharide concentration reached 1 mg/mL the scavenging rate of superoxide radical， DPPH and hydroxyl radical was 96.96%， 48.53% and 94.95%， respectively. The IR results showed that polysaccharide is beta-pyranose. It indicated that Gomphidius rutiluss polysaccharide has a high antioxidant capacities and a bright future of development and utilization.

Key words： Gomphidius rutilus; polysaccharide; antioxidant; IR

紅松蘑学名血红铆钉菇（Chroogomphidius viscidus），俗称松树伞、红蘑，主要分布于中国的东北、西南的松树林地之间，是口感很不错的食用野生菌，有“素肉”之称[1-3]。红松蘑富含多种氨基酸，蛋白质可达到18%以上（鲜重），维生素B族、膳食纤维可达24%以上（鲜重），多糖5%左右等[4，5]。此外，其还含有多酚、黄酮、脂肪酸、甾和萜类、香豆素等成分[6-11]，针对以上成分，主要进行了多糖、黄酮的抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等活性研究[12，13]，相关研究结果表明其多糖活性比较高且具有良好的开发利用价值，为此，相关课题组进一步开展菌丝发酵、酶促多糖工艺优化、采用DEAE-52及CL-8分离纯化等研究[14-17]。同时李震等[18]开展抗疲劳功能饮料的研制，取得了一定成果。自由基可以破坏RNA/DNA、结合破坏蛋白质及酶体系，进而干扰机体的细胞代谢[19-21]，从而加速机体的衰老，可直接或间接引起衰老、病变（肿瘤）、变态反应等[22，23]，补充抗氧化物质具有较好的临床及保健价值[18，21，22]。现阶段虽然对红松蘑多糖做了较多的研究，但是不同产区红松蘑研究结果存在一定差异，同时对红松蘑多糖结构的相关研究较少见。因此，本试验以东北牡丹江地区红松蘑为对象，研究其抗氧化活性，旨在为相关研究提供有益的参考。

1  材料与方法

1.1  材料

东北红松蘑，采自牡丹江地区，经过牡丹江师范学院曲秀春教授鉴定为血红铆钉菇，标本藏于牡丹江师范学院标本馆。

主要试剂：溴化钾（AR，上海国药集团），焦性没食子酸（AR，上海琳帝化工有限公司），七水硫酸亚铁（AR，天津博迪化工股份有限公司），无水乙醇（AR，天津进丰化工有限公司），食用酒精（95%，黑龙江华润酒精有限公司），1，10-菲罗啉 （AR，瓦里西化工），L-抗坏血酸（AR，上海埃彼化学试剂有限公司），30%双氧水、盐酸（AR，哈尔滨试剂厂），R-10纤维素酶，Y-23果胶酶（BR，日本Yakult公司），DPPH（97%，日本TCI公司）等。

主要仪器：JHBE-50T型闪式提取器（成都市宜邦科析仪器有限公司）;SL-2010N型超声波萃取装置（南京顺流设备有限公司）; T6型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;PB-10型酸度计，BSA224S-CW型电子天平（德国赛多利斯集团）;LGJ-18S型冷冻真空干燥机（郑州鸣一仪器设备有限公司）;RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣仪器有限公司）等。

1.2  方法

1.2.1  多糖提取  取1 000 g红松蘑切碎后，以无水乙醇为提取剂，料液比（g∶mL，下同）1∶5，在闪式提取器提取，搅拌转速为5 000 r/min，提取时间为120 s，提取2～3次，除掉脂溶性成分及部分色素，残渣低温干燥后备用[24]。

以纯水为提取剂，每100 g红松蘑加入1%～2%果胶酶、2%纤维素酶，控温50 ℃，pH 5下酶促反应2 h;微波灭活1～2 min;以料液比（g∶mL）1∶10加入水，功率800 W，超声波提取60 min，提取2次，合并滤液，浓缩至原体积1/10，反复冷冻，6 000 r/min离心处理至热水溶解无沉淀，Sevage法除去蛋白，-70 ℃预冻8～12 h，冷冻干燥后丙酮再次脱色备用[25，26]。

1.2.2  多糖抗氧化性研究  样品液制备：精确称取1.000 g多糖，纯水配制成10 mg/mL的提取物溶液作为母液。用母液分别配制1.0～0.2 mg/mL的溶液[27]。维生素C溶液现用现配，部分浓度低于0.2 mg/mL。

1）超氧自由基清除能力测定。依据文献[28，29]方法采用邻苯三酚自氧化法，以维生素C为对照，测定多糖对超氧自由基的清除能力，总时间控制在3.5～4.0 min内，依据以下公式计算清除率，检测3次结果取平均值。

清除率=[（CA-CB）/CA]×100%

式中，CA为自氧化时吸光度，CB为加入样品溶液（或维生素C）后吸光度。

2）羟基自由基清除能力测定。依据文献[30，31]的方法略有改变，以维生素C为对照，在510 nm下，采用菲罗啉-FeSO4-H2O2体系测定羟基自由基清除能力，并依据以下公式计算清除率，检测3次结果取平均值。

清除率=[1-（Q0-Q1）/（Q2-Q1）]×100%

式中，Q0为样品（或维生素C）+菲罗啉-FeSO4-H2O2体系溶液的吸光度;Q1为H2O2溶液+空白样品体系溶液的吸光度;Q2为不加H2O2和样品（或维生素C）体系溶液的吸光度。

3）DPPH自由基清除能力测定。依据文献[26，30]的方法略有改动，以维生素C为对照，在520 nm下暗条件反应30 min，并依据以下公式计算清除率，检测3次结果取平均值。

清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%

式中，D0为DPPH和95%乙醇的吸光度;D1为DPPH和待测样品的吸光度;D2为待测样品（或维生素C）和95%乙醇的吸光度。

1.2.3  多糖的红外表征  将“1.2.1”获得的粗多糖用去离子水配成溶液，通过Sevage法除去蛋白后，反复醇沉、离心、冷冻干燥、备用。采用溴化钾压片法制样，在红外光谱仪上检测其红外光谱。

2  结果与分析

2.1 多糖对超氧自由基的清除作用

由图1可见，浓度为0.3 mg/mL的多糖对超氧自由基的清除率与维生素C几乎相等，随着多糖浓度升高其清除作用逐渐加强，显示浓度-清除率具有一定线性相关性（R2=0.943，P<0.05），浓度在0.8 mg/mL时其清除率可达78%以上，1.0 mg/mL时清除能力趋于饱和。

2.2  多糖对羟基自由基的清除作用

由图2可见，当多糖浓度在0.4 mg/mL时，其对羟基自由基的清除率接近维生素C，0.6 mg/mL以上时其清除率均高于维生素C，最高清除率可达到94%以上，显示出较好的清除效果。由于羟基自由基与人体衰老有一定联系，所以红松蘑多糖具有一定潜在的抗衰老活性及价值，这与文献[18]的研究结果较为接近。同时在研究浓度范围内其浓度与清除率显示较好的线性相关性（R2=0.973，P<0.05）。

2.3  多糖对DPPH自由基的清除作用

在整个试验浓度区间多糖对DPPH自由基的清除率上升较为平缓，这与文献[12]的结果较为吻合，在浓度1.0 mg/mL时就达到48%以上，表现出一定的抗氧化效果，与文献[12]的研究结果存在一定差异，这可能与检测方法及多糖纯度或红松蘑产区有一定关系，同时在研究浓度范围内多糖浓度与清除率显示较好的线性相关性（R2=0.982，P<0.05）。

2.4  多糖红外测定結果

由图4可见，在3 331.33 cm-1附近的强吸收峰为O-H或N-H伸缩振动峰;在2 926.45 cm-1处的尖峰是C-H（-CH2）伸缩振动峰;其897.13 cm-1、1076.79 cm-1、1 029.58 cm-1为吡喃糖特征吸收之一[24，32，33]，在1 653.21 cm-1处的强尖峰是C=O（-CHO）的伸缩振动峰，表明此多糖为吡喃糖;568.35 cm-1的弱小尖峰是β-吡喃环弯曲振动峰。以上结果说明多糖为β-型吡喃多糖[34]。

3  结论

在样品测定浓度范围内，东北红松蘑多糖浓度与其对自由基的清除率均显示良好的线性相关（R2>0.9，P<0.05），其红外表征显示多糖为β-型吡喃多糖。其对羟基自由基（·OH）的清除率最高为94.95%，对超氧离子自由基（·O2-）的清除率最高为96.96%，浓度在0.4 mg/mL以上时其清除效果均优于维生素C。由于羟基自由基及超氧离子自由基均与衰老有一定相关性，表明东北红松蘑多糖具有潜在抗衰老应用前景。

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