背根神经节脉冲射频对CCI 模型大鼠机械性痛阈及相关炎性因子表达的影响

蒋雨斌　李平　马旭杰　王芬　江仁　李红

[摘要] 目的 通過制备慢性坐骨神经缩窄损伤（CCI）模型，并对模型大鼠实施背根神经节（DRG）脉冲射频（PRF），探讨其对SD大鼠模型的干预效果及机制研究。 方法 60只雄性SD 大鼠随机分为4 组：假手术组（Sham）、CCI组、CCI+PRF组、CCI+假脉冲射频组（CCI+NPRF组），每组15只。观察大鼠造模前及造模后1、3、5、7 d，脉冲射频后1、7、14 d的痛阈改变。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用ELISA检测脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1的表达;造模前、CCI-1 d、PRF-1 d检测大鼠血清中TNF-α、IL-6细胞因子变化。 结果 与Sham 组比，CCI组、CCI+PRF组、NPRF组大鼠在神经损伤后右后爪PWMT和PWTL均显著降低（P<0.05），而脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1表达增强，大鼠血清TNF-α、IL-6表达明显上升（P<0.05）。PRF治疗后CCI+PRF组大鼠机械性痛阈较其他三组显著升高（P<0.05），但仍低于Sham组（P<0.01），脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1表达则明显减少，同时血清中TNF-α、IL-6表达明显下降（P<0.05）。 结论 脉冲射频能有效减轻CCI模型大鼠的痛敏，其机制可能与抑制趋化因子SDF-1/CXCR4、TRPV1及调节TNF-α、IL-6的表达有关。

[关键词] 神经病理性疼痛;脉冲射频;背根神经节;炎性因子

[中图分类号] R402          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）07-0023-05

Impacts of dorsal root ganglion pulsed radiofrequency on paw withdrawal mechanical threshold and relevant inflammatory factors in chronic constriction injury rat models

JIANG Yubin1   LI Ping1   MA Xujie1   WANG Fen2   JIANG Ren1   LI Hong1

1.Department of Anesthesiology， Ningbo Yinzhou No.2 Hospital， Ningbo   315100， China; 2.Department of Anesthesiology， Ningbo Women and Childrens Hospital， Ningbo   315012， China

[Abstract] Objective To investigate the therapeutic effects of dorsal root ganglion（DRG） pulsed radiofrequency（PRF） on chronic constriction injury（CCI） of sciatic nerve models in Sprague-Dawley（SD） rats， and elucidate the mechanism behind it. Methods Sixty male SD rats were randomly divided into 4 groups， namely the Sham group， the CCI group， the CCI+PRF group and the CCI+non-PRF（NPRF） group， with 15 in each group. Paw withdrawal mechanical threshold（PWMT） and paw withdrawal thermal latency（PWTL） were detected before modeling， at 1， 3， 5 and 7 days after modeling and at 1， 7 and 14 days after PRF. Stromal cell-derived factor-1（SDF-1）/CXCR4 ratio and the level of transient receptor potential vanilloid-1（TRPV1） in the spinal cord were determined before modeling， at 7 days after modeling and at 14 days after PRF using an ELISA assay. Serum levels of tumor necrosis factor-α（TNF-α） and interlukin-6（IL-6） were determined before modeling， at 1 day after modeling and at 1 day after PRF. Results After CCI modeling， PWMT and PWTL in the right hind paw significantly decreased in the CCI， CCI+PRF and CCI+NPRF groups， accompanied by an increased SDF-1/CXCR4 ratio and up-regulations of TRPV1 in the spinal cord and TNF-α and IL-6 in the serum compared with the Sham group（P<0.05）. PWMT significantly increased in the CCI+PRF group compared with other three groups after treatment（P<0.05）， but still decreased compared with the Sham group（P<0.01）. After PRF treatment， the SDF-1/CXCR4 ratio and TRPV1 expression in the spinal cord and serum levels of TNF-α and IL-6 significantly decreased in the CCI+PRF group（P<0.05）. Conclusion PRF effectively ameliorated hyperalgesia in CCI rats. The underlying mechanism may associate with the repressed SDF-1/CXCR4 ratio and expressions of TRPV1， TNF-α and IL-6.

[Key words] neuropathic pain; pulsed radiofrequency; dorsal root ganglion; inflammatory factors

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是一种由神经系统原发性损害和功能障碍所激发或引起的疼痛，具有自发性疼痛、痛觉过敏或超敏的特征[1]。Sluijter等于1997年首次提出脈冲射频（pulsed radio frequency，PRF）技术用于镇痛治疗，目前PRF已广泛用于治疗颈源性头痛、颈腰椎间盘退行性病变等多种慢性疼痛疾病[2-4]。尽管在许多研究中均表明PRF有明确的镇痛效果，但其镇痛机制还未完全明确。已知某些趋化因子可以增加背根神经节和脊髓神经元的兴奋性。其中基质细胞衍生因子SDF-1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）又称为CXCL12属于趋化因子CXC类，CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1（CXCL12）的特异受体。Yang等[5]研究发现，在NP模型大鼠的背根神经节和脊髓中均能检测到SDF-1和CXCR4上调。已知趋化因子诱导神经元兴奋性增加与瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道密切相关，TRP通道拮抗剂能衰减神经源性、强直性和神经性疼痛的强烈反应。其中脊髓中瞬时感受器电位香草酸受体1（TRPV1）是位于外周及中枢系统的离子通道型受体，当被激活后导致离子通道开放，已经证明TRPV1在疼痛通路的突触传递中起着重要的作用。尤其是在病理性疼痛状态下，感觉神经元和间质神经元中央端TRPV1可能共同导致疼痛加重。另外研究发现，在沉默脊髓TRPV1基因的表达后，可通过抑制CAMKII/ERK2的激活减弱神经性疼痛的维持[6]。本实验选择CCI模型模拟临床神经病理性疼痛，并应用DRG脉冲射频，观察其对大鼠脊髓内SDF-1/CXCR4及TRPV1以及机械性痛阈的影响，探讨背根神经节PRF镇痛作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康雄性SD大鼠60只，体重（250±30）g，清洁级，购自中国科学院上海实验动物中心。本研究经过地方实验动物伦理委员会批准通过。脉冲射频仪 （Cosman RF-G4，美国）、22G 射频治疗套管针（Cosman RF-G4，美国）、Digital Von Frey测痛仪（Stoelting公司，美国）、全自动热痛刺激仪（PL-200型，成都泰盟科技有限公司）、TRPV1酶联免疫检测试剂盒购于上海双赢生物科技有限公司、SDF-1和CXCR4试剂盒购于EIAab公司、TNF-α和IL-6试剂盒均购自碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验分组  60只SD大鼠适应性饲养1周后，随机分为4组：假手术组（Sham组）、慢性坐骨神经缩窄损伤组（CCI组）、CCI +PRF组、CCI+假脉冲射频组（CCI+NPRF组）。各组大鼠于术后7 d在术侧L4-5间隙DRG处行360 s的标准PRF治疗。CCI+NPRF组仅暴露在射频刺激针下，不予脉冲治疗。造模前，CCI后1 d、3 d、5 d、7 d，PRF后1、7、14 d四组大鼠均进行痛阈测定。造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，采用ELISA检测脊髓SDF-1/CXCR4、TRPV1的表达，造模前、CCI-1 d、PRF-1 d检测大鼠血清TNF-α、IL-6细胞因子变化。

1.2.2 模型制备  采用Bennett等[7]的方法建立大鼠CCI 模型：10%水合氯醛腹腔麻醉后俯卧位四肢固定，右侧后肢股骨处剃毛消毒，外科手术刀切开皮肤，并钝性剥离肌肉，暴露出坐骨神经干，利用4.0铬制肠线环绕神经干分别做4个结扎环，间距1 mm，观察到小腿部肌肉颤动为最佳结扎力度。术毕缝合消毒，单笼饲养。

1.2.3 脉冲射频  DRG 治疗方法制作CCI模型后7 d，于大鼠腰5棘突旁右侧切开剥离，暴露L4-5横突及椎间孔，射频穿刺针尖沿与神经根走形平行方向轻柔置于L4和L5椎间孔内进行阻抗测试，运动测试未引起相应节段脊神经支配的显著的下肢肌肉收缩运动，确认穿刺针针尖位于DRG，位置正确后予3 Hz的频率和20 ms/次的参数42℃脉冲射频360 s。手术后，注射青霉素以防止感染。

1.2.4 机械刺激缩足反应痛阈值（paw withdrawal-mechanical threshold，PWMT）测量  按Chaplan等[8]研究的方法，使用Von Frey纤维通过“上-下”法测量PWMT。将不同压力的Von Frey纤维丝从底部垂直刺激大鼠右后足底中心持续 6～8 s，大鼠的抬高或跛足行为被认为是阳性反应，否则是负反应。每只大鼠测 3 次，每次间隔 10 min，取平均值。

1.2.5 热刺激缩足反应潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）的测量  将PL-200型自动热疼痛刺激仪温度设定为50℃，每次适应5 min后将大鼠置于热疼痛刺激仪上，记录大鼠受热刺激后收缩反应热痛觉的指示作为热痛觉潜伏期。每只大鼠测3次，每次间隔10 min，取平均值。

1.2.6 ELISA检测大鼠脊髓SDF-1/CXCR4及TRPV1含量变化  造模前、CCI-7 d、PRF-14 d，在麻醉状态下，外科手术迅速将大鼠脊髓L4-5节段取下，置于液氮反复冻融后匀浆，整个过程都在冰上进行，然后在4℃、12000 转/min离心30 min，小心吸出上清液并储存在-80℃。按照ELISA实验操作及试剂盒说明进行测定。

1.2.7 ELISA检测大鼠血清TNF-α、IL-6细胞因子变化  造模前、CCI-1 d、PRF-1 d，每组大鼠经颈静脉窦取血2 mL，离心留取血清，按照ELISA实验操作及TNF-α、IL-6试剂盒说明进行测定。

1.3 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较及组内比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学观察

各组大鼠随机分组后一般资料如体重、生长饮食及神经行为学检查等差异无统计学意义（P>0.05），见表1。CCI术后除Sham组外，各组大鼠生长及饮食减少，但各组大鼠体重比较无明显差异。CCI组均出现不同程度的右后肢步态跛行，下肢软弱无力，右后足外翻及肌肉萎缩等状态。CCI+PRF组大鼠在脉冲射频后，上述症状明显改善，活动量明显增加。

2.2 大鼠PWMT 和PWTL测定比较

（1）PWMT的比较：CCI前各组大鼠基础值比较无统计学差异。Sham组术后各时间点PWMT与术前基础值相比，无明显统计学差异。造模后，CCI组和CCI+NPRF组PWMT较术前明显降低，第7天至最低（P<0.01）。CCI+PRF组大鼠经脉冲射频后第1、7、14天，术后痛觉敏感度逐渐恢复，PWMT较CCI组和CCI+NPRF组显著升高（P<0.01），CCI+PRF组PWMT从（2.46±0.59）g（CCI-7 d）上升至（7.30±0.61）g（PRF-14 d）。见图1A。

（2）各组PWTL的比较：CCI前各组大鼠基础值比较无统计学差异。Sham组术后各时间点PWTL与术前基础值相比，无明显统计学差异。造模后，CCI组和CCI+NPRF组PWTL较术前明显降低，第7天至最低（P<0.01）。脉冲射频后，CCI+PRF组PWTL从（4.17±0.40）s（CCI-7 d）上升至（7.11±0.52）s（PRF-14 d），CCI+PRF组大鼠经脉冲射频后，术后痛觉敏感度逐渐恢复，PWTL较CCI组和CCI+NPRF组显著升高（P<0.01）。见图1B。

2.3 大鼠脊髓中SDF-1/CXCR4及TRPV1含量检测

造模前各组大鼠脊髓中趋化因子SDF-1/CXCR4含量及TRPV1含量几乎没有差异，且含量较低。CCI术后7 d，与Sham组比较，CCI组、CCI+NPRF组、CCI+PRF组表达显著增加（P<0.05），但这三组两两比较无显著性差异。CCI+PRF组大鼠经脉冲射频后14 d脊髓组织中SDF-1/CXCR4及TRPV1含量较CCI组和CCI+NPRF组显著降低（P<0.05），但仍高于Sham组（P<0.05），见表2。

2.4 各组大鼠血清中细胞因子含量检测

造模前各组大鼠血液中细胞因子TNF-α、IL-6含量无明显差异。CCI术后1 d，与Sham组比较，CCI组、CCI+NPRF组、CCI+PRF组表达显著增加（P<0.05），但这三组两两比较无显著性差异。CCI+PRF组大鼠经脉冲射频后1 d血清中TNF-α、IL-6含量较CCI组和CCI+NPRF组显著降低（P<0.05），见表3。

3 讨论

NP是一种慢性、顽固性疼痛，目前没有任何特殊的治疗，仅姑息治疗方法可用于暂时缓解症状，给患者造成巨大痛苦，严重影响患者的生存质量[9]。虽然NP的治疗目前仍是基于药物为主，长期增加剂量容易产生耐药性和严重的副作用，而镇痛效果不能得到保证。有研究证实，大鼠背根神经节脉冲射频能有效缓解神经病理性疼痛[10-11]。脉冲射频能刺激脉冲，从而使神经可不受进一步损伤并达到缓解疼痛的目的，所以其在临床中的应用日益广泛，包括用于治疗带状疱疹后神经痛、周围神经痛、难治性颈源性头痛等，但仍有较多问题有待进一步研究以增进临床疗效[2-4，12-15]。

NP可由外周敏化或中枢敏化产生，当末梢神经受损时，伤害信息被发送并集成通过传入神经，然后通过脊髓、丘脑等传送，并且最终在大脑皮层形成疼痛。因此我们选择脊髓部位相关因子作为研究观察的切入点。Vallejo R等[16]利用SNL模型，实验组给予PRF 3 min，24 h后测定坐骨神经、DRG和脊髓的炎性因子等表达，发现脉冲射频组不但能逆转SNI模型导致的痛觉过敏，而且与实验组相比，射频组坐骨神经炎性因子表达恢复到基础水平，包括TNF-α、IL-6，背根神经节GABAB-R1、Na/K ATP、5-HT3表达明显上升，同时TNF-α、IL-6明显下降，脊髓Na/K ATP和c-Fos上调。Liu Y等[17]发现在CCI模型中，将射频电极放置于大鼠坐骨神经的结扎近端，与对照组相比，PRF能显著提高CCI大鼠的热痛阈，逐渐降低痛觉过敏和痛觉超敏的比例。有研究证实，背根神经节脉冲射频可以降低由CCI引起的TNF-α的表达增加[18]。

另外，趋化因子是一小分子细胞因子家族蛋白，已知某些趋化因子可以增加背根神经节和脊髓神经元的兴奋性。其中基质细胞衍生因子SDF-1属于趋化因子CXC类，CXCR4是趋化因子基质细胞衍生因子-1（CXCL12）的特异受体。研究发现，建立神经病理性模型和癌痛模型后，在DRG和脊髓中均能发现SDF-1和CXCR4上调[19]。交感神经节和DRG都起源于神经嵴细胞（neural crest cell，NCC），近侧的神经嵴细胞演变为DRG，SDF-1、CXCR4信號系统不同表达。已知趋化因子诱导神经元兴奋性增加与TRP通道密切相关，TRP通道拮抗剂能衰减神经源性、强直性和神经性疼痛的强烈反应。TRPV1是TRPV亚家族中发现最早也是研究最为充分的一个。TRPV1被炎性物质激活后，导致大量的Ca2+内流，引起细胞去极化，感觉神经兴奋，触发外围感觉，最终诱导术后疼痛和慢性疼痛的形成。有研究发现，SNI[20-21]和CCI[22]模型造成的NP 模型中TRPV1表达上调和P物质在脊髓增多等产生镇痛作用。

本研究以CCI大鼠模型模拟人类临床所见的各种慢性疼痛的症状。本研究术前脊髓SDF-1/CXCR4及TRPV1呈低水平表达，CCI后趋化因子SDF-1/CXCR4及瞬时感受器电位受体TRPV1表达显著增加，并于损伤后的观察期内维持高水平，这与上述研究结果类似，再次证明了SDF-1/CXCR4及TRPV1参与了NP的形成，同时大鼠CCI模型血清刺激产生促炎因子TNF-α、IL-6变化，表明炎性因子在痛阈产生中具有重要作用。因此，我们推测：PRF后可能通过抑制DRG中小胶质细胞激活，抑制趋化因子表达，从而抑制交感神经芽生，同时抑制TRPV1激活神经元，减少促炎因子释放来缓解疼痛。

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（收稿日期：2019-06-18）