CK7、CK19在238例肝穿组织的表达

石亚星，周 珈，王小莹，钱忠义，申丽娟，章宗籍

（昆明医科大学基础医学院病理学与病理生理学系，云南昆明 650500）

肝脏疾病在我国各类疾病中占有较大比例，尤其乙型肝炎（简称乙肝），是最常见的肝脏疾病类型。除乙肝外，自身免疫性肝病，如原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC），现称原发性胆汁性胆管炎（primary biliary cholangitis，PBC）、原发性胆汁性胆管炎合并自身免疫性肝炎（primary biliary cholangitis combined with autoimmune hepatitis，PBC-AIH）等肝脏疾病的发生率也日益增加[1]。目前对各类肝脏疾病筛查主要通过肝炎病毒标志物检测、自身免疫性抗体检测和肝脏酶学指标检测等方法[2]。这些方法只能初步判断肝脏的基本病变，确切诊断结果往往需要依靠肝脏穿刺病理学组织检查。免疫组化检测在其中占有重要地位，对于肝脏疾病的确诊及鉴别诊断具有重要意义。CK7和CK19是人体肝脏中卵圆细胞或肝脏干细胞的高表达标志物，被广泛应用于胆管细胞标记[3-4]。现将近年来收集的肝脏穿刺病例进行CK7和CK19免疫组化检测，探讨CK7和CK19在肝脏穿刺活检病理诊断中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象

2014年1月至2018年12月昆明医科大学基础医学院病理学教研室肝脏穿刺活检病例标本。

1.2 纳入及诊断标准

1.2.1 纳入标准（1）乙肝纳入标准[5]：肝脏穿刺活检有炎症表现，免疫组化检查乙型肝炎表面抗原阳性；（2）不明原因肝炎纳入标准：除外乙肝、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎；（3）PBC纳入标准[6]：①血清ALP（碱性磷酸酶）至少大于2UNL或GGT（谷氨酸激酶）至少大于5UNL；②血清AMA（抗线粒体抗体）阳性；③肝组织穿刺活检显示汇管区胆管损伤；（4）PBC-AIH纳入标准：至少有两项标准分别符合PBC和AIH的诊断。

1.2.2 诊断标准（1）PBC诊断标准同纳入标准；（2）AIH诊断标准[7]：①ALT（谷丙转氨酶）至少大于5 UNL；②血清IgG至少大于2 UNL或SMA（抗平滑肌激动蛋白抗体）阳性；③肝脏穿刺活检显示中至重度的界面炎，小叶内炎症重。

1.3 研究方法

1.3.1 HE染色 脱蜡至水-苏木素染色-伊红染色-中性树胶封片。

1.3.2 免疫组化染色 切片脱蜡至水-抗原修复-抗孵育-二抗孵育-DAB显色-中性树胶封片。染色过程中所需试剂盒及HBsAg单克隆抗体、CK7单克隆抗体、CK19单克隆抗体均购自福州迈新公司。

1.3.3 结果判定 采用半定量法判断结果，分别对阳性细胞所占的百分比和染色强度给予评分[8]。阳性细胞所占百分比：＜5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，76%～100%计4分。阳性细胞染色强度：无着色计0分，淡黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。最后两项计分相乘：0分为阴性（-）表达，1～4分为弱阳性（+）表达，5～8分为阳性（++）表达，9～12分为强阳性（+++）表达。

1.4 统计学处理

采用SPSS软件对数据进行统计学处理。连续型变量采用均数±标准差（）表示。连续型变量资料组间比较采用单因素方差分析；分类变量资料组间比较采用完全随机设计行×列表资料χ2检验和非参数Wilcoxon秩和检验。分类变量资料组内比较采用配对χ2检验（McNemar检验）和配对秩和检验。采用双侧检验，检验标准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特征

共收集238例肝病病例，包括乙肝组37例，不明原因肝炎组93例，PBC组89例和PBC-AIH组19例。四组肝病病例的性别、年龄差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 238例肝病病例的基本临床特征（）Tab.1 Basic clinical features of 238 cases of liver disease（）

表1 238例肝病病例的基本临床特征（）Tab.1 Basic clinical features of 238 cases of liver disease（）

2.2 四组肝病病例的病理表现

2.2.1 乙肝 是最常见的肝脏病理类型。肝脏穿刺活检有不同程度肝细胞水肿、变性、坏死等炎性表现，免疫组化检查HBsAg（乙型肝炎表面抗原）阳性，见图1A。

2.2.2 不明原因肝炎 肝脏穿刺活检有不同程度肝细胞水肿、变性、坏死等炎性表现，排除乙肝、脂肪性肝炎、酒精性肝炎、自身免疫性肝炎，见图1B。

2.2.3 PBC肝脏穿刺活检主要表现为慢性、进行性肝内胆汁淤积，以肝内中小胆管非化脓性肉芽肿性炎症为特征，见图1C。

2.2.4 PBC-AIH兼有AIH（自身免疫性肝炎）和PBC两者的临床和病理学特点，主要组织病理学特征为：中至重度界面炎、肝细胞肿胀或嗜酸性坏死，弥漫性炎细胞浸润，见图1D。

图1 四组肝病病例Fig.1 Liver disease cases in four groups

2.3 四组肝病病例的CK7、CK19免疫组化染色结果

2.3.1 四组肝病病例的CK7免疫组化染色结果CK7主要表达于炎症区域的病变胆管上皮细胞和淤胆肝细胞，在乙肝、不明原因肝炎、PBC及PBC-AIH中表达部位无明显差异，见图2。

2.3.2 四组肝病病例的CK7免疫组化染色结果CK19主要表达于炎症部位的胆管上皮细胞，在4组肝病病例中表达部位无明显差异，见图3。

图2 四组肝病病例的CK7表达（SP×100）Fig.2 Expression of CK7 in four-group liver disease cases（SP×100）

图3 四组肝病病例的CK19表达Fig.3 Expression of CK19 in four-group liver disease cases

2.4 CK7和CK19免疫组化染色的半定量分析结果

四组肝病病例的CK7和CK19的免疫组化半定量分析结果如表2所示。其中，CK7和CK19的表达强度比较采用非参数Wilcoxon秩和检验，结果显示四组肝病病例的CK7和CK19的表达强度差异均有统计学意义（P＜0.05），说明四组肝病病例肝组织内CK7、CK19表达强度不全相同；CK7和CK19的表达阳性率比较采用完全随机设计行×列表资料的χ2检验，结果显示CK7和CK19的表达阳性率差异均有统计学意义（P＜0.05），说明四组肝病病例肝组织内CK7、CK19表达阳性率不全相同。

2.5 四组肝病病例CK7和CK19免疫组化染色结果组内比较

2.5.1 CK7与CK19阳性率比较 将各组内CK7与CK19表达阳性率进行比较，McNemar检验结果显示除PBC-AIH组外，各组差异有统计学意义（P＜0.001），CK7表达阳性率较高，见表3。

表2 238例肝病病例CK7与CK19表达情况（n）Tab.2 CK7 and CK19 expression in 238 cases of liver diseases（n）

表3 CK7与CK19表达阳性率组内比较Tab.3 A comparison of CK7 and CK19 positive expression rates in the groups

2.5.2 CK7与CK19表达强度比较 将各组内CK7与CK19表达强度进行比较，结果显示CK7表达强度较CK19高，各组CK7与CK19表达强度差异均有统计学意义（P＜0.05），见表4。

2.6 四组肝病病例CK7和CK19免疫组化结果组间比较

2.6.1 CK7阳性率组间比较 根据表2得知四组肝病病例的CK7表达阳性率不全相同，进一步对CK7阳性率进行组间两两比较。结果显示不明原因肝炎组与PBC组的CK7表达阳性率差异具有统计学意义（P＜0.05），其余组间比较CK7阳性率差异无统计学意义（P＞0.05），见表5。

表4 CK7与CK19表达强度组内比较（n）Tab.4 Comparisons of CK7 and CK19 expression intensity in the groups（n）

表5 CK7表达阳性率组间比较Tab.5 Comparisons of CK7 expression positive rates in the groups

2.6.2 CK7表达强度组间比较 根据表2得知四组肝病病例的CK7表达强度不全相同，进一步对CK7表达强度进行组间两两比较。结果显示不明原因肝炎组与PBC组差异具有统计学意义（P＜0.05），其余组间比较CK7表达强度差异无统计学意义（P＞0.05），见表6。

2.6.3 CK19阳性率组间比较 根据表2得知四组肝病病例的CK7表达阳性率不全相同，进一步对CK7阳性率进行组间两两比较。结果显示不明原因肝炎组与PBC-AIH组及PBC组与PBC-AIH组CK19阳性率相比差异无统计学意义（P＞0.05），其他组间比较CK19阳性率差异有统计学意义（P＜0.05），见表7。

2.6.4 CK19表达强度差异组间比较 根据表2得知四组肝病病例的CK19表达强度不全相同，进一步对CK19表达强度进行组间两两比较，结果显示不明原因肝炎组与PBC-AIH组及PBC组与PBC-AIH组差异无统计学意义（P＞0.05），其他组间比较CK19表达强度差异均有统计学意义（P＜0.05），见表8。

表6 CK7表达强度组间比较Tab.6 Comparisons of CK7 expression intensity in the groups

表7 CK19表达阳性率组间比较Tab.7 Comparisons of CK19 expression positive rate in the groups

表8 CK19表达强度组间比较Tab.8 Comparisons of CK19 expression intensity in the groups

3 讨论

本研究对四组肝脏疾病共238例肝脏穿刺样本进行了CK7和CK19免疫组化染色，结果显示CK7主要表达于胆管上皮细胞和淤胆的肝细胞（图2）；CK19主要表达于胆管上皮细胞（图3）。在238例中，乙肝组37例，CK7阳性28例、阴性9例，阳性率75.7%；CK19阳性3例、阴性34例，阳性率8.1%。不明原因肝炎组93例，CK7阳性65例、阴性28例，阳性率69.9%；CK19阳性29例、阴性64例，阳性率31.2%。PBC组89例，CK7阳性80例、阴性9例，阳性率89.9%；CK19阳性50例、阴性49例，阳性率56.2%；PBC-AIH组19例，CK7阳性15例、阴性4例，阳性率78.9%；CK19阳性9例、阴性10例，阳性率47.4%。

在四组肝病病例中，CK7和CK19在PBC中的阳性率最高，提示CK7和CK19检测可能有助于PBC的临床诊断。目前PBC临床诊断主要依据血清AMA阳性和肝脏穿刺活检显示肝内胆汁淤积、中小胆管增生及肉芽肿形成等非化脓性炎性病变[9]。本实验免疫组化结果显示，CK7和CK19可表达于PCB时增生的胆管上皮细胞（图2C、图3C），为PBC患者肝脏病变的典型特征之一。因此，CK7和CK19免疫组化检测对PBC的临床诊断具有辅助价值。另外，有研究者将PBC患者肝脏样本的CK7免疫组化染色结果与HE染色结果进行对比，发现CK7免疫组化染色可以观察到更多被慢性炎症细胞隐藏的胆管[10]。对比本研究的PBC HE染色（图1C）与免疫组化染色（图2C、图3C）结果，也可发现CK7和CK19染色比HE染色能够更清晰地显示胆管病变，提示CK7、CK19，尤其CK7免疫组化检测比依靠常规HE诊断PBC的敏感性更高。

另外，本实验进行了四组肝脏疾病的CK7和CK19免疫组化染色阳性率及表达强度差异的组内和组间比较。组内比较结果显示：除PBC-AIH外，各组CK7阳性率比CK19阳性率较高（表3），且四组CK7表达强度均比CK19更高（表4），提示CK7检测对肝病病例的诊断敏感性具高，其检测可能比CK19更有意义。组间比较结果显示：CK7阳性率及表达强度仅在乙肝组与PBC、不明原因肝炎组与PBC组差异具有统计学意义（表5、表6）；CK19阳性率及表达强度在不明原因肝炎组与PBC-AIH组及PBC组与PBC-AIH组无明显差异，其余组间比较差异具有统计学意义（表7、表8）。综合组间比较结果发现，CK7和CK19免疫组化染色在乙肝与PBC、不明原因肝炎组与PBC组表达阳性率和表达强度差异均有统计学意义，而在PBC组与PBC-AIH组均无差异。因此，CK7和CK19检测可能对乙肝与PBC、及不明原因肝炎与PBC的鉴别诊断具有一定的临床意义，而不能作为PBC与PBC-AIH的鉴别指标。由于本研究中PBC-AIH例数较少，具有一定的局限性，尚需扩大样本量进一步实验证实CK7、CK19在PBC与PBC-AIH中的表达差异。

CK7和CK19作为重要的免疫学指标近年来被广泛应用于肝脏病理研究[11－12]。有研究报道[13]，CK19阳性是肝细胞癌术后早期复发的预测指标；还有研究表明[14]，CK7和CK19在细胆管癌中几乎均为阳性。因此，CK7、CK19作为重要的胆管细胞标志物对各类肝脏疾病的鉴别诊断具有重要意义，需进一步研究。

综上所述，CK7主要表达于胆管上皮细胞和淤胆的肝细胞，CK19主要表达于胆管上皮细胞。肝穿组织CK7和CK19免疫组化染色对肝脏病变，尤其PBC的病理学诊断具有辅助价值。除常规HE、网状纤维染色和胶原纤维染色外，建议将CK7和CK19作为病理学检测指标应用于肝穿组织的检测。